Siyanobakteriyel Kültür Senkronizasyonu ve Aydınlık-Karanlık Döngüleri Tarafından Yönlendirilen DNA Sıkıştırma

Özet

Kaynak: Murata, K. ve diğerleri, Siyanobakterilerde DNA Sıkışmasının Yüksek Voltajlı Kriyo-elektron Tomografisi ile Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, sirkadiyen tarafından düzenlenen DNA sıkışmasını incelemek için aydınlık-karanlık döngüler altında siyanobakterilerin eşzamanlı olarak yetiştirilmesini göstermektedir. Floresan mikroskobu, tanımlanmış zaman noktalarında yoğunlaştırılmış DNA'yı ortaya çıkararak popülasyon genelinde hücre döngüsü hizalamasını doğrular.

Protokol

1. Siyanobakterilerin Senkron Kültürü

1. Kültür Synechococcus elongatus PCC 7942,% 1.5 (a / h) agar ve% 0.3 (a/h) sodyum tiyosülfat içeren sterilize edilmiş mavi-yeşil ortam 11 (BG 11) plaka (9 cm steril plastik petri kabında).
2. Plakaları 23 °C'de 50 μE/^m2/s ışık yoğunluğuna sahip bir büyüme odasına yerleştirin ve 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngülere tabi tutun.
3. Hücreleri haftada bir kez taze BG11 agar plakalarına aktarın.
   NOT: Agar üzerindeki kültürler, bu kültür koşulları altında bir hafta sonra aktif olarak çoğalan hücrelerin yeşil bantları olarak görünecektir.
4. Alevle sterilize edilmiş bir tel halka ile yeşil hücre kümeleri alın ve hücreleri taze bir BG11 agar plakasına çizin. Bunu temiz bir bankta yapın.

2. Floresan Mikroskobu ile İzleme

1. DNA sıkışmasını gözlemlemek için agar plakasında kültürlenen hücreleri 6 gün boyunca kullanın. Işık periyodunun sonunda hücrelerin üzerine 1 mL 0,2 M sükroz çözeltisi dökerek plakadan hücreleri toplayın. Hücrelerin çoğunun toplanması için çözeltiyi hücrelere dökmeyi tekrarlayın. DNA boyama için askıya alınmış hücre çözeltisini bir mikrotüpe aktarın.
2. DNA boyama boyası (örneğin, Hoechst 33342) çözeltisini, bir mikrotüpteki 500 μL'lik askıya alınmış hücre çözeltisine, 1 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar ekleyin. Ardından tüpü 10 dakika karanlıkta tutun.
3. Hücreleri çökeltmek için 2.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve yoğun bir hücre süspansiyonu elde etmek için 10 μL 0,2 M sükroz çözeltisi ekleyin.
4. Lekeli hücreler içeren çözeltinin 1 μL'sini bir slayt camına aktarın, bir lamel koyun ve 100X büyütmeli bir objektif lens ve daldırma yağı kullanarak ultraviyole (UV) filtre ile donatılmış bir floresan mikroskobu ile gözlemleyin.
5. Çoğu hücrede bu noktada DNA sıkışmasının gözlemlendiğini doğrulayın.

Malzemeler