Hücresiz Bir Sistem Kullanılarak Nanodisk ile Stabilize Edilmiş Membran Protein Antijenlerinin Sentezi

Özet

Kaynak: Gilmore, S.F., ve diğerleri. Aşı Geliştirme için Chlamydia muridarum'dan Rekombinant Majör Dış Membran Proteinine Hücresiz Ölçekli Üretim ve Adjuvan İlavesi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, çift bölmeli bir sistem kullanılarak nanodisk ile stabilize edilmiş membran protein antijenlerinin hücresiz sentezini göstermektedir. Cihaz, verimli protein sentezi, uygun katlama ve nanodisklere stabil entegrasyon için en uygun koşulları korur.

Protokol

Alt birim aşı formülasyonları için Majör dış membran protein-telodendrimer nanolipoprotein partiküllerinin (MOMP-tNLP'ler) hücresiz üretimi

1. MOMP-tNLP'leri hücresiz yöntemler kullanarak hazırlayın.
   1. Hücresiz reaksiyonu kurmadan iki saat önce, prokaryotik hücresiz protein ekspresyon kitini açın ve sulandırma tamponlarından birini çözün. Çözüldükten sonra, bir tablet etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içermeyen proteaz inhibitör kokteyli ekleyin ve tamamen çözünmesini bekleyin.

2. 5 x 1 mL reaksiyonları çalıştırmak için tasarlanmış bir kit kullanarak bu protokolü izleyin.

   NOT: Tipik bir ölçek büyütme üretimi 3 x 1 mL'dir.

   1. Her 1 mL reaksiyon için, E. coli lizat şişesine 525 μL sulandırma tamponu ekleyin ve çözünmesi için hafifçe yuvarlayın. Reaksiyon katkı maddeleri (örneğin, Adenozin trifosfat, Guanozin trifosfat) içeren şişeye 250 μL sulandırma tamponu ekleyin ve çözünmesi için hafifçe yuvarlayın.
   2. Reaksiyon besleme şişesine 8,1 mL sulandırma tamponu ekleyin, kauçuk bir tıpa ile kapatın (kauçuk tıpanın iç kısmına dokunmamaya dikkat edin) ve çözünmesi için yavaşça ters çevirin/yuvarlayın.
   3. Amino asit karışım şişesine 3 mL sulandırma tamponu ekleyin, kauçuk bir tıpa ile kapatın ve çözünmesi için hafifçe ters çevirin/yuvarlayın.
      NOT: Kirlenmeye yol açabileceğinden lastik tıpanın iç kısmına dokunmamaya dikkat edin.
   4. Metiyonin şişesine 1,8 mL sulandırma tamponu ekleyin, çözünmesi için hafifçe yuvarlayın ve ardından kullanıma kadar buz üzerinde saklayın.
       
3. Reaksiyon çözeltisini hazırlayın.
   1. E. coli lizat şişesine, 225 μL sulandırılmış Reaksiyon Karışımı, 270 μL metiyonin içermeyen sulandırılmış amino asit karışımı ve 30 μL sulandırılmış metiyonin ekleyin. Ek olarak, 400 μL 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DMPC)/telodendrimer karışımı, 15 μg MOMP plazmidi ve 0.6 μg Δ49ApolipoproteinA1 plazmidi ekleyin. Karıştırmak için yuvarlayın/hafifçe sallayın.
      NOT: Her iki plazmitin de aynı plazmit omurgasından yapıldığından emin olun. Girdap yapmayın.
   2. Toplam çözeltiden 20 μL alın ve Yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden kontrol reaksiyonu için 1.5 mL'lik bir tüpe koyun (aşağıya bakınız).
       
4. Besleme solüsyonunu hazırlayın. Yem karışımı şişesine, metiyonin içermeyen 2.65 mL sulandırılmış amino asit karışımı ve 300 μL sulandırılmış metiyonin ekleyin. Çözünmesi için yuvarlayın/hafifçe sallayın.
   NOT: Şu anda, kullanılmayan sulandırma tamponu ve Metiyonin, saklama için dondurucuya geri gönderilebilir.
    
5. 1 mL reaksiyon solüsyonunu hücresiz reaksiyon kitinde sağlanan iç reaksiyon odasına aktarın ve doldurulduğunda kapatın. 10 mL besleme solüsyonunu reaksiyon kabının dış bölmesine aktarın ve kapatın.
   NOT: Hazneleri aşırı doldurmayın! Hem iç reaksiyon odasının hem de iç besleme odasının üst kısmında hava kabarcıklarının bulunması reaksiyonu olumsuz etkileyecektir. Kalan herhangi bir reaksiyon çözeltisi 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirilebilir ve ana kap boyunca karışmasına izin verilebilir.
    
6. Daha önce aliquote edilmiş 20 μL reaksiyon karışımına 0.5 μL GFP kontrol plazmidi (0.5 mg/mL) ekleyin.
   NOT: Birçok kit, kalite kontrol amacıyla bir kontrol plazmidi ile birlikte verilir. Bir T7 promotörü ve E.coli ribozom bağlanma bölgesi (RBS) ile plazmit eksprese eden çoğu GFP, kontrol plazmidi olarak da kullanılabilir.
    
7. Reaksiyonu 300 rpm, 30 °C'de 18 saate kadar bir çalkalayıcıya yerleştirin. Reaksiyonun başarılı olduğunu doğrulamak için, 15 dakika kadar kısa bir inkübasyondan sonra kontrol GFP'sinin (Şekil 1) sentezi nedeniyle floresansı kontrol etmek için bir UV ışık kaynağı kullanın.
   NOT: Bu koşulların, özellikle sıcaklığın, diğer zar proteinlerinin ekspresyonu için optimize edilmesi gerekebilir.

Sonuçlar

Şekil 1: MOMP-tNLP'nin ekspresyonu ve saflaştırılması. (A) GFP plazmidi olmayan lizatlara (solda) kıyasla UV ışık kaynağı (sağda) altında ışıma yapan GFP kontrollerini başarıyla eksprese eden hücresiz bir reaksiyonun...

Malzemeler