Bakteriyel Aşı Antijeninin Yapısal Bütünlüğünü Değerlendirmek için Western Blot

Özet

Kaynak: Gilmore, S. F. ve diğerleri. Aşı Geliştirme için Chlamydia muridarum'dan Rekombinant Majör Dış Membran Proteinine Hücresiz Ölçekli Üretim ve Adjuvan İlavesi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, nanopartikül bazlı aşı kompleksleri içindeki ana dış zar proteininin (MOMP) yapısal bütünlüğünü değerlendirmek için Western blotlamanın kullanımını göstermektedir. Protein transferi, antikor etiketleme ve floresan görüntüleme ile ilgili temel adımları özetlemektedir.

Protokol

1. Batı lekesi

1. Western blotlama için, ana dış membran proteini (MOMP)– telodendrimer nanolipoprotein partiküllerini (tNLP'ler) SDS-PAGE ile çözün ve jelleri, üreticinin protokolüne göre standart ayarlara sahip ticari bir kuru lekeleme sistemi kullanarak aktarın.
   1. Transfer tamamlandıktan sonra lekeleri yığından çıkarın ve her bir lekeyi gece boyunca 4 °C'de% 0.2 Tween 20 ve 0.5 mg / mL monoklonal antikor (MAb) 40 veya 0.2 mg / mL MAbHIS anti-His-tag antikoru içeren uygun bir bloke edici tamponda inkübe edin.
      NOT: Kurutma için kullanılan antikor seyreltmeleri, MAb40 için 1:1.000 ve MAbHIS antikoru için 1:500-1.000'dir.
   2. Her lekeyi PBS-T (1x fosfat tamponlu salin (PBS), %0,2 Tween 20, pH 7,4) ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
   3. Lekeleri, 1:10.000 seyreltmede bir florofora konjuge edilmiş ikincil antikor (örneğin, Kızılötesi boya (IRDye)) içeren bloke edici tamponda 1 saat inkübe edin.
   4. Lekeleri PBS-T ile 5 dakika boyunca 3 kez tekrar yıkayın. Son yıkamadan sonra lekeleri görüntülemek için bir floresan görüntüleyici kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
iBlot+2:22 Kuru Kurutma Sistemi	Yaşam Teknolojileri
iBlot 2 Transfer Yığınları, PVDF	Yaşam Teknolojileri	IB24001
Image Studio V2.0 yazılımı	Li-COR Biyobilim
Immun-Blot PVDF Membran	Biyo-Rad	1620177
LI-COR Odyssey Fc görüntüleyici	Li-COR Biyobilim
%0.2 Tween 20 içeren TBS'de Odyssey Engelleme Arabelleği	Li-COR Biyolojik Bilimler	927-50000
Yörünge Çalkalayıcı
PBS-T (1x PBS, %0,2 Tween 20, pH 7,4)
Birincil antikor: MAb40 ( C. muridarum MOMP'nin değişken alan 1'ine (VD1) karşı monoklonal antikor
Birincil antikor: MAbHIS, Penta-His antikoru	Qiagen	34660
İkincil antikor: IRDye 800CW keçi (poliklonal) anti-fare IgG (ağır ve hafif)	Li-COR Biyolojik Bilimler	926-32210