Yüksek Voltajlı Elektroporasyon Kullanılarak Bakterilerin Hazırlanması ve Dönüşümü

Özet

Kaynak: Stefan, A., ve diğerleri, Escherichia coli'de Protein Birlikte Ekspresyonunun Çok Yönlü Faydaları. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, hücre hazırlama, elektroporasyon, geri kazanım ve transformantların seçimi dahil olmak üzere Escherichia coli'yi antibiyotik direnç geni taşıyan bir plazmit ile dönüştürme prosedürünü göstermektedir.

Protokol

1. E. coli Yardımcı transformantlarının İzolasyonu

1. Dönüştürülecek uygun E. coli suşunun elektro-yetkin hücrelerini hazırlayın. 1 ml Luria-Bertani (LB) ortamına (sırasıyla 10, 5 ve 10 g / L'de Tripton, Maya Ekstraktı, NaCl) tercih edilen suşun tek bir kolonisine aktarın ve 180 rpm çalkalama koşulları altında 37 ° C'de inkübe edin. Ön kültürü 25 ml taze LB ortamında 1:500 oranında seyreltin ve kültürü 37 °C'de inkübe edin.
2. Log fazında (0.6 OD veya optik yoğunluk), hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin ve peleti orijinal kültür hacminin yarısında% 10, v / v buz gibi steril gliserol-su içinde yeniden süspanse edin. Yeniden süspansiyon hacmini yarıya indirerek bu adımı 4 kez tekrarlayın. Son olarak, peleti gliserol/su içinde yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 50 μl'lik alikotlara bölün. Alikotları -80 °C'de 6 aya kadar saklayın.
3. İstenilen plazmidi 0,5 mM EDTA (etilendiamintetraasetik asit) ile desteklenmiş steril suda çözün. Elektro-yetkin hücrelerin bir kısmını buz üzerinde çözün ve uygun miktarda (2.5-5 ng) vektör ile karıştırın. Karışımı elektroporasyona uygun 0,1 cm'lik bir küvete dağıtın ve 1,8 kV uygulayın.
4. Elektroporasyonlu hücreleri hemen 1 ml SOC (katabolit baskılamalı süper optimal et suyu) ortamına (% 0.2 w / v glikoz, 10 mM MgCl₂, 2.5 mM KCl ile desteklenmiş LB ortamı) aktarın, çalkalayarak 1 saat inkübe edin ve son olarak 100 ul alikotları uygun antibiyotikle LB agar içeren Petri kaplarına aktarın. O/N'yi 37 °C'de inkübe edin.
5. Petri kapları üzerinde tek kolonileri çizerek transformantları saflaştırın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agar	Sigma-Aldrich	A1296 Serisi
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9518 Serisi
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Gliserol	Sigma-Aldrich	G5516 Serisi
Kartal	Sigma-Aldrich	P9541
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M2670 Serisi
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
Tripton	Sigma-Aldrich	95039
Maya özü	Fluka	70161
Küvetler 0,1 cm	BioRad	1652089	Elektroporasyon için
Santrifüj 5415R	Eppendorf Belediyesi
Santrifüj Allegra 21R	Beckman
Gen Pulser II elektroporasyonu	BioRad