Yüksek Voltajlı Elektroporasyon Kullanılarak Bakterilerin Hazırlanması ve Dönüşümü

Abstract

Kaynak: Stefan, A., ve diğerleri, Escherichia coli'de Protein Birlikte Ekspresyonunun Çok Yönlü Faydaları. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, hücre hazırlama, elektroporasyon, geri kazanım ve transformantların seçimi dahil olmak üzere Escherichia coli'yi antibiyotik direnç geni taşıyan bir plazmit ile dönüştürme prosedürünü göstermektedir.

Protocol

1. E. coli Yardımcı transformantlarının İzolasyonu

1. Dönüştürülecek uygun E. coli suşunun elektro-yetkin hücrelerini hazırlayın. 1 ml Luria-Bertani (LB) ortamına (sırasıyla 10, 5 ve 10 g / L'de Tripton, Maya Ekstraktı, NaCl) tercih edilen suşun tek bir kolonisine aktarın ve 180 rpm çalkalama koşulları altında 37 ° C'de inkübe edin. Ön kültürü 25 ml taze LB ortamında 1:500 oranında seyreltin ve kültürü 37 °C'de inkübe edin.
2. Log fazında (0.6 OD veya optik yoğunluk), hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin ve peleti orijinal kültür hacminin yarısında% 10, v / v buz gibi steril gliserol-su içinde yeniden süspanse edin. Yeniden süspansiyon hacmini yarıya indirerek bu adımı 4 kez tekrarlayın. Son olarak, peleti gliserol/su içinde yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 50 μl'lik alikotlara bölün. Alikotları -80 °C'de 6 aya kadar saklayın.
3. İstenilen plazmidi 0,5 mM EDTA (etilendiamintetraasetik asit) ile desteklenmiş steril suda çözün. Elektro-yetkin hücrelerin bir kısmını buz üzerinde çözün ve uygun miktarda (2.5-5 ng) vektör ile karıştırın. Karışımı elektroporasyona uygun 0,1 cm'lik bir küvete dağıtın ve 1,8 kV uygulayın.
4. Elektroporasyonlu hücreleri hemen 1 ml SOC (katabolit baskılamalı süper optimal et suyu) ortamına (% 0.2 w / v glikoz, 10 mM MgCl₂, 2.5 mM KCl ile desteklenmiş LB ortamı) aktarın, çalkalayarak 1 saat inkübe edin ve son olarak 100 ul alikotları uygun antibiyotikle LB agar içeren Petri kaplarına aktarın. O/N'yi 37 °C'de inkübe edin.
5. Petri kapları üzerinde tek kolonileri çizerek transformantları saflaştırın.

Materials