Beta-Glukozidaz Testi Kullanılarak Bakterilerde Mutasyon Sıklığının Değerlendirilmesi

Abstract

Kaynak: Stefan, A., ve diğerleri. Escherichia coli'de Protein Birlikte Ekspresyonunun Çok Yönlü Faydaları. J. Vis. Uzm. (96), (2015).

Bu video, bir beta-glukozidaz testi kullanılarak bakterilerde mutasyon sıklığının değerlendirilmesini göstermektedir. Düzeltme okuması eksik bir DNA polimeraz eksprese eden bakteri kültürleri, ardışık nesiller boyunca toplanır. Azaltılmış düzeltme okumasının neden olduğu replikasyon hataları, bastırılmış bir beta-glukozidaz genini aktive edebilir. Santrifüjleme ve geçirgenleştirmeden sonra, bir substrat eklenir ve numuneler arasındaki mutasyon sıklığını ölçmek için enzim aktivitesi ölçülür.

Protocol

1. Escherichia coli veya E. coli Ko-transformantlarının izolasyonu

1. Dönüştürülecek uygun E. coli suşunun elektro-yetkin hücrelerini hazırlayın. 1 ml Luria-Bertani (LB) ortamına (sırasıyla 10, 5 ve 10 g / L'de Tripton, Maya Ekstraktı, sodyum klorür veya NaCl) tercih edilen suşun tek bir kolonisine aktarın ve 180 rpm çalkalama koşulları altında 37 ° C'de inkübe edin. Ön kültürü 25 ml taze LB ortamında 1:500 oranında seyreltin ve kültürü 37 °C'de inkübe edin.
2. Log fazında (0.6 OD), hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin ve peleti orijinal kültür hacminin yarısında% 10, v / v buz gibi soğuk steril gliserol su içinde yeniden süspanse edin. Bu adımı 4 kez tekrarlayın ve her seferinde yeniden süspansiyon hacmini yarıya indirin. Son olarak, peleti gliserol/su içinde yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 50 μl'lik alikotlara bölün. Alikotları -80 °C'de 6 aya kadar saklayın.
3. İstenilen plazmidi 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile desteklenmiş steril suda çözün. Elektro-yetkin hücrelerin bir kısmını buz üzerinde çözün ve uygun miktarda (2.5-5 ng) vektör ile karıştırın. Karışımı elektroporasyona uygun 0,1 cm'lik bir küvete dağıtın ve 1,8 kV uygulayın.
4. Elektroporasyonlu hücreleri derhal katabolit baskılama (SOC) ortamı (% 0.2 w / v glikoz, 10 mM magnezyum klorür veya MgCl₂, 2.5 mM potasyum klorür veya KCl ile desteklenmiş LB ortamı) ile 1 ml süper optimal et suyuna aktarın, çalkalayarak 1 saat inkübe edin ve son olarak 100 μl alikotları uygun antibiyotikle LB agar içeren Petri kaplarına aktarın. Gece boyunca (O/N) 37 °C'de inkübe edin.
5. Petri kapları üzerinde tek kolonileri çizerek transformantları saflaştırın.
6. Birincil transformantların elektro-yetkin hücrelerini hazırlayın ve daha fazla plazmit ile dönüştürmek için 1.1 ila 1.5 arasındaki adımları tekrarlayın.
7. Yardımcı transformantların gliserol stoklarını hazırlayın. Uygun antibiyotiklerle desteklenmiş LB'de tek bir koloniyi aktarın, çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edin ve log fazında (0.6 OD), hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin. Pelet, %15 v/v gliserol içeren LB-antibiyotik ortamında yeniden süspanse edin. Parçalar halinde dağıtın ve – 80 °C'de saklayın.

2. E. coli DNA Polimeraz III ve Mutajenik εD12A Varyantının Vahşi Tip ε Alt Birimini Birlikte İfade Eden Popülasyonların Mutasyon Analizi

1. pBAD-ε ve pGOOD1-εD12A vektörlerini içeren tek bir E. coli TOP10 kolonisini 1 ml LB-antibiyotik ortamına aktarın. O/N'yi 37 °C'de inkübe edin.
2. Ön kültürü taze ortam (10 ml) içeren 3 şişede 1:250 seyreltin, uygun indükleyicileri (arabinoz, izopropil β-d-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) veya arabinoz ve IPTG, her biri 1 mM) ekleyin ve 37 ° C'de 8 saat inkübe edin. Paralel olarak indüklenmemiş kültürler hazırlayın.
3. 1 ml'lik alikotları toplayın, ardından uygun indükleyicilerle desteklenmiş veya desteklenmemiş taze ortam (10 ml) içeren yeni şişelerde 1:500 oranında seyreltin. O/N'yi 37 °C'de inkübe edin.
4. 2.2 ve 2.3 adımlarını tekrarlayın ve 1 ml'lik alikotları toplayın.
5. Her kültürde meydana gelen nesil sayısını belirleyin. LB plakalarına transfer, 100 ul uygun seri inokulum ve kültür dilüsyonları. O/N'yi 37 °C'de inkübe edin. LB plakalarındaki kolonileri sayın ve aşıda (log_I) ve büyümenin sonunda kültürde (log_C) bulunan hücre sayısının logunu hesaplayın. Nesil sayısını belirlemek için şu formülü kullanın: (log_C– log_I)/0.301.
6. 20 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin ve hücreleri 1 ml 50 mM tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorür (Tris-HCl), pH 7.6, 50 mM NaCl içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri geçirgen hale getirmek için 2-3 damla kloroform ekleyin ve 20 saniye vorteks yapın.
7. Substrat olarak p-nitrofenil-β-D-glukopiranozid (PNPGluc) kullanarak 96 oyuklu bir mikroplakadaki her bir alikotun β-glukozidaz aktivitesini belirleyin. Her oyuğa 100 ul geçirgen hücre ve 100 μl substrat (su veya_H2Oiçinde 16 mg/ml stok çözeltisi) ekleyin. Kuyularda hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Bir mikroplaka okuyucu ve uygun filtre kullanarak 420 nm'de Absorbansı okuyun.

Materials