Plastoglobüllerin Fotosentetik Bakterilerden Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Bu makalede

Özet

Kaynak: Shivaiah, K., ve diğerleri. Bitki Yaprak Dokusundan ve Siyanobakterilerden Plastoglobül Lipid Damlacık İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)

Video, plastoglobüllerin siyanobakterilerden izolasyonunu göstermektedir. Bir siyanobakteri kültürü ile başlar ve mekanik kuvvet kullanarak hücre bozulması yoluyla ilerler. Fotosentetik pigmentlerin salınması, başarılı bir lizizi gösterir. Daha sonra hücresel bileşenleri yoğunluğa göre ayırmak için bir sükroz adım gradyanı kullanılır ve düşük yoğunluklu plastoglobüllerin üstte ayrı bir bant oluşturmasına izin verir. Bu fraksiyon toplanır ve daha fazla analiz için saklanır.

Protokol

1. Ham plastoglobül izolasyonu

Siyanobakterilerden ham plastoglobül ekstraksiyonu
1. 50 mL'lik bir Synechocystis sp. PCC 6803'ü sabit faza (yaklaşık 7-10 gün) getirin ve bir spektrofotometre kullanarak hücre yoğunluğunu 750 nm'de (OD₇₅₀) 2.0'lık bir Optik Yoğunluğa ayarlayın. Kültür koşulları için, BG-11 ortamını kullanın ve bir inkübatörde 150 μmol foton/^m2/s, %2 CO₂, 32 °C ışık yoğunluğunda ve dakikada 150 devirde (rpm) sürekli çalkalama ile büyütün.
2. Polisakkaritleri çıkarmak için, 50 mL kültürü 6.000 × g'da 45 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyerek ve ardından süpernatanı çıkararak hücreleri yıkayın. Hücreleri 50 mL tampon A'da iki kez yıkayarak devam edin (Tablo 1). Hücre homojenatının bir kısmını çıkarın ve temsili bir toplam hücre numunesi olarak saklanmak üzere santrifüjlemeden önce bir kenara koyun
3. Yıkanmış peleti 25 mL Tampon A içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri inç kare başına 1.100 pound (psi) hızında bir Fransız basınç hücresi kullanarak kırın, işlemi 3× tekrarlayın (protein denatürasyonunu önlemek için numuneyi her döngü arasında buza koyun) parçalanmış renk beyaz ışık altında yeşilden kırmızı-mavi-yeşile değişene kadar. Önceden soğutulmuş bir hücre kullanın ve bu adımı soğuk odada gerçekleştirin.
4. Elde edilen homojenatı, her tüpte maksimum 2,5 mL'ye kadar doldurulmuş sekiz adet 3 mL ultrasantrifüj tüpü arasında dağıtın ve ardından bir adım gradyanı oluşturarak 400 μL orta R ile dikkatlice kaplayın.
5. Gerektiğinde ilave ortam R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin ve 4 °C'de 150.000 × g'da 30 dakika santrifüjleyin. Tilakoid ve diğer daha ağır organeller (herhangi bir polihidroksialkanoat cisimciği dahil) peletlenirken, plastoglobüller sakaroz gradyanının tepesinde veya yakınında sarı, yağlı bir ped olarak kolayca görülecektir (Şekil 1C).
6. Elde edilen yüzen ham plastoglobül pedini bir şırınga ve 22G iğne ile toplayın ve 2 mL'lik bir tüpe bırakın. Gerekirse iğne ucuyla ultrasantrifüj tüpü duvarının yan tarafındaki plastoglobülleri kazıyın.
7. Adım 2.2'ye geçin. Alternatif olarak, ham plastoglobülleri -80 °C'de saklayın ve daha sonra saflaştırın.

Tablo 1: Bitki yaprak dokusundan veya siyanobakterilerden plastoglobül izolasyonu için tampon tarifleri.

Tampon bileşimleri ^a
Öğütme Tamponu	50 mM HEPES-KOH (PH: 8.0)
	5 mM Magnezyum klorür (MgCl₂ )
	100 mM sorbitol
	5 mM askorbik asit ^b
	5 mM azaltılmış sistein ^b
	%0,05 (w/v) Sığır Serum Albümini (BSA) ^b
Orta R	50 mM HEPES-KOH (PH: 8.0)
	5 mM MgCl₂
Orta R 0.2	50 mM HEPES-KOH (PH: 8.0)
	5 mM MgCl₂
	0,2 M sükroz
Orta R 0,7	50 mM HEPES-KOH (PH: 8.0)
	5 mM MgCl₂
	0,7 M sükroz
Tampon A	25 mM HEPES-KOH (pH 7.8)
	250 mM sükroz
a. Her tampon bileşeninin nihai konsantrasyonları sağlanır.
b. İzolasyon gününde taze olarak eklenmelidir. Tamponlar izolasyondan bir gün önce hazırlanabilirken, bazı bileşenlerin yanı sıra herhangi bir fosfataz ve proteaz inhibitörü izolasyon gününde taze olarak eklenmelidir.

2. Saf plastoglobüllerin toplanması

Siyanobakteri işleme
1. Dört adet 2.5 mL ultrasantrifüj tüpünde bir sakaroz gradyanı üretin, önce 750 μL orta R 0.7 ile karıştırılmış adım 1.3'ten 500 μL ham plastoglobüller ile katmanlanmış, ardından 750 μL orta R 0.2 ile kaplanmıştır.
2. Sükroz gradyanını 4 ° C'de 90 dakika boyunca 150.000 × g'da santrifüjleyin. Saf plastoglobülleri (Şekil 1C) sükroz gradyanının üst fazından bir şırınga ve 22 G iğne ile toplayın ve 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
3. Saf plastoglobülleri ayırın ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun. Doğrudan -80 °C'de saklayın veya kuru bir toz haline getirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Plastoglobüllerin ve tilakoidlerin izolasyonu ve immünoblotlaması. (A) Sükroz gradyanından ekstraksiyondan önce Z. mays'ten temsili bir saflaştırılmış plastoglobül örneği. (B) Sükroz yastığın...