Siyanobakteriyel Plastoglobüllerin Yoğunluk Gradyanlı Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Shivaiah, K., ve diğerleri. Bitki Yaprak Dokusundan ve Siyanobakterilerden Plastoglobül Lipid Damlacık İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, sükroz yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılarak plastoglobüllerin siyanobakterilerden izolasyonunu göstermekte, lipit açısından zengin, düşük yoğunluklu yapılarını vurgulamakta ve aşağı akış analizi için yapısal korumalarını sağlamaktadır.

Protokol

1. Saf plastoglobüllerin toplanması

1. Siyanobakteri işleme
   1. Önce 750 μL ortam R 0.7 ile karıştırılmış adım 1.3'ten 500 μL ham plastoglobüller ile katmanlanmış dört adet 2.5 mL ultrasantrifüj tüpünde bir sakaroz gradyanı üretin, ardından 750 μL ortam R 0.2 ile kaplayın (Tablo 1)
   2. Sükroz gradyanını 4 ° C'de 90 dakika boyunca 150.000 x g'da santrifüjleyin. Saf plastoglobülleri (Şekil 1C) sükroz gradyanının üst fazından bir şırınga ve 22 G iğne ile toplayın ve 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   3. Saf plastoglobülleri ayırın ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun. Doğrudan -80 °C'de saklayın veya kuru bir toz haline getirin.

Tablo 1: Siyanobakterilerden plastoglobül izolasyonu için tampon tarifleri.

Orta R	50 mM HEPES-KOH (PH: 8.0)
	5 mM MgCl2
Orta R 0.2	50 mM HEPES-KOH (PH: 8.0)
	5 mM MgCl2
	0,2 M sükroz
Orta R 0,7	50 mM HEPES-KOH (PH: 8.0)
	5 mM MgCl2
	0,7 M sükroz

Sonuçlar

Şekil 1: Plastoglobüllerin ve tilakoidlerin izolasyonu ve immünoblotlaması. (A) Sükroz gradyanından ekstraksiyondan önce Z. mays'ten temsili bir saflaştırılmış plastoglobül örneği. (B) Sükroz yastığın...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HEPES	Sigma Aldrich	H3375 Serisi
Magnezyum klorür	Sigma Aldrich	M8266 Serisi
Sakaroz	Sigma Aldrich	S9378 Serisi
Synechocystis sp. PCC 6803	YOK	YOK
Optima MAX-TL Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	A95761 Serisi