$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Sıvı kültürde solucanları canlı bakterilerle beslemek
NOT: Bu protokol, sıvı kültürde iyi karıştırılmış koşullarda laboratuvarda yetiştirilen bakterilerle solucanları kolonize etmek için kullanılır. Solucanlar, saf kültürden (örneğin, Enterococcus faecium gibi patojenler) veya izolat karışımlarından (örneğin, minimal mikrobiyom toplulukları) elde edilen bireysel izolatlarla kolonize edilebilir.
- 15 mL'lik konik bir tüpte sakarozla yıkanmış senkronize yetişkin solucanlarla başlayın. Solucanları 12 mL S tamponunda bir kez yıkayın ve süpernatanı atın.
- Yıkanmış solucanları deney için gereken S ortamı hacminde yeniden süspanse edin. Deneysel koşulların hacmini, solucanların bölüneceği koşulların sayısını ve solucanların ve bakterilerin nihai konsantrasyonlarını göz önünde bulundurun.
NOT: Solucanlarda beslenme, bakteri mevcudiyetine göre değişir ve solucanlar kalabalık nedeniyle strese girebilir. Sıvı kültürde kolonizasyon için <1000 solucan/mL ve >107 CFU/mL önerilir; 1011 CFU/mL, E. coli üzerinde "ad libitum" besleme yoğunluğu olarak kabul edilir. - Bakteri kültürlerini döndürün. Süpernatanı dökün; Gevşek topaklar oluşturan bakteriler için süpernatanı uzaklaştırmak için aspirasyon veya pipetleme kullanılabilir.
NOT: >5 mL'lik kültürler için, 15 mL'lik tüplere aktarın ve büyük bir masa üstü santrifüjde ~2800 x g'da 8-10 dakika döndürün. <5 mL'lik kültürler 1.5 mL'lik tüplere aktarılabilir ve küçük bir masa üstü santrifüjde 1-2 dakika boyunca 9000 x g'da santrifüjlenebilir. Yüksek derecede hareketli bakterilerin (örneğin, birçok Pseudomonas türü) stabil bir pelet oluşumunu kolaylaştırmak için 4 °C'de 10-15 dakika soğutulması gerekebilir ve 4 °C'de santrifüjlemek daha iyi olabilir. - Bakteri kültürlerini bir hacim S tamponunda yeniden süspanse edin ve pelet için tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı daha önce olduğu gibi çıkarın ve atın.
- Bakteri kültürlerini deney için istenen yoğunlukta S ortamında ve ayrıca seçim için herhangi bir antibiyotiğin yeniden süspanse edilmesi. Varsa kullanılacak antibiyotikler, kolonizasyon için kullanılan bakterilerin direnç profiline bağlı olacaktır.
- %0,01 Triton X-100 (M9TX-01) ile desteklenmiş M9 solucan tamponu ile kaplanmış bir pipet ucu kullanılarak, pipet solucanları, solucanlar S ortamında tamamen yeniden süspanse edilene kadar yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirir, ardından bakteri kolonizasyonu için tüplere veya plaka kuyucuklarına aktarılır.
- İstenilen bakteri konsantrasyonuna ve nihai hacme ulaşmak için her solucan kültürüne bakteri süspansiyonu ekleyin.
- Kolonizasyon için çok oyuklu bir plaka kullanılıyorsa, plakayı steril 96 oyuklu gaz geçirgen bir sızdırmazlık membranı ile örtün.
- İnkübasyon sırasında bakterilerin yerleşmesini önlemek için 200 RPM'de çalkalayarak inkübe edin.
2. 96 oyuklu bir formatta bireysel solucanların mekanik olarak bozulması
NOT: Bu bölüm, bireysel bakteriyel olarak kolonize C . elegans'ın mekanik olarak bozulması için 96 oyuklu bir plaka formatı protokolünü açıklamaktadır. Protokoldeki ilk adımlar, yapışmamış bakterileri solucan bağırsağından temizlemek ve soğuk felç ve yüzey ağartma kullanarak solucanların dışını temizlemek için bir yöntemi açıklar. Bu adımlar, bakteri içeriğinin miktarının belirlenmesi için mekanik olarak bozulabilen veya daha ileri deneyler için kullanılabilen temiz, canlı yetişkin solucanlar üretecektir. Bu protokol, sıvı kültürde, agar plakalarında veya doğal veya mikrokozmos toprağında kolonize olan solucanlardaki bakterileri ölçmek için uyarlanabilir.
- Soğutmak için buzun üzerine bir M9TX-01 alikotu yerleştirin (mL cinsinden numune sayısının 4-5 katı).
- M9TX-01 + ağartıcıdan (%6 sodyum hipoklorit, 1:1000 veya 1:2000 v/v, numune başına 1 mL + 1 mL ekstra) oluşan bir kısım hazırlayın ve soğuması için buzun üzerine koyun.
- Her solucan örneğini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL M9TX-01 içinde yeniden süspanse edin.
- Yetişkinleri pelet etmek için tüpleri 25 °C'de düşük hızlı bir mini santrifüjde (2.000 x g) kısa süreliğine (2-3 s) döndürün. Süpernatanı pipetleyin ve solucan peletini rahatsız etmediğinizden emin olarak atın.
- Santrifüjleme kullanarak, dış bakterileri azaltmak için solucanları iki kez 1 mL M9TX-01 ile, ardından bir kez 1 mL M9 solucan tamponu ile durulayın.
- Yapışmamış bakterileri solucan bağırsağından temizleyin.
- Her solucan örneğini bir kültür tüpünde 1 mL S ortamı + 2x ısıyla öldürülmüş OP50 içinde yeniden süspanse edin.
- Yapışmamış bakterilerin bağırsaktan geçişine izin vermek için 25 °C'de 20-30 dakika inkübe edin.
NOT: Bu aynı zamanda herhangi bir hücre dışı floresan proteini lümenden temizleyecek ve özellikle aside dirençli floroforlar (örneğin, mCherry, dsRed) kullanıldığında, bağırsak epiteline yapışan etiketli bakterilerin daha net görüntülenmesini sağlayacaktır.
- Dış bakterileri temizlemek için yüzey ağartıcı solucanları.
- Temizlenmiş solucanları 1 mL soğuk M9TX-01 ile iki kez durulayın ve süpernatanı atın.
- Tüplerin buz üzerinde (tercih edilir) veya 4 °C'de 10 dakika soğumasına izin verin. Bu, solucanları felç edecek ve çamaşır suyunun yutulmasını önleyecektir.
NOT: Diğer protokoller, levamizol gibi kimyasal bir felç ajanı kullanır; Bu, tehlikeli atık akışının eklenmesini gerektiren yerleşik bir yaklaşımdır. - Her tüpe 1 mL buz gibi soğuk M9 solucan tamponu + kokusuz ağartıcı (%8,25 sodyum hidroksit, 1:1000 veya 1:2000 v/v) ekleyin. Dış bakterileri öldürmek için tüplerin buz üzerinde (tercih edilir) veya 4 °C'de en az 10 dakika beklemesine izin verin.
NOT: 1:1000 çamaşır suyu konsantrasyonunu aşmayın. Felçli solucanlarda bile ölümle sonuçlanabilir. - Çamaşır suyu tamponunu pipetleyin ve atın; Solucanların çamaşır suyu temizlenene kadar pompalamaya devam etmemesini sağlamak için tüpleri buza geri koyun.
- Her tüpe 1 mL soğuk M9TX-01 ekleyin. Bir mini santrifüjde ~5 saniye döndürün (25 °C'de 2.000 x g ); tüpleri buza geri döndürün. Süpernatanı çıkarın ve atın.
- Bu durulama adımını 1 mL soğuk M9TX-01 ile tekrarlayın ve mümkün olduğunca fazla süpernatantı atın.