Konakçı-Bakteri Etkileşimlerindeki Değişkenliği Değerlendirmek için Bireysel Solucanların Mekanik Bozulması

Özet

Kaynak: Taylor, M. N. ve diğerleri. Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucan Verilerini Kullanma. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, bireysel Caenorhabditis elegans'ta bağırsak bakteri yükü değişkenliğinin mekanik bozulma yoluyla ölçülmesini göstermektedir. Bireysel solucanlar arasındaki bağırsak bakteri yükündeki farklılıkları değerlendirmek için numune hazırlama, mekanik bozulma, seri seyreltme ve koloni sayımı adımlarını özetlemektedir.

Protokol

1. Mekanik bozulma için solucanları silisyum karbür tanecikli derin 96 oyuklu bir plakaya ayırın. 96 oyuklu bozulma plakasını aşağıdaki gibi hazırlayın.
   1. Steril 2 mL derin kuyulu 96 oyuklu bir plaka ve uygun bir silikon 96 oyuklu plaka kapağı elde edin.
      NOT: Doku bozucu için 96 oyuklu adaptörlerle uyumlu plakların kullanılması önemlidir. Dış boyutlardaki küçük farklılıklar, adaptörlerden çıkarılabilen bir plaka ile çıkarılamayan bir plaka arasındaki farkı yaratır.
   2. Steril bir kepçe spatula kullanarak, bir solucan alacak plakanın her bir oyuğuna az miktarda steril 36 kumlu silisyum karbür ekleyin. Kuyunun dibini zar zor kaplayacak kadar kum kullanın (kuyu başına yaklaşık 0,2 g). Aşırı malzeme, içindekileri alırken pipet ucunun kuyunun dibine ulaşmasını zorlaştıracaktır.
   3. Her kuyucuğa 180 μL M9 solucan tamponu ekleyin.
   4. Her numunenin nereye gideceğini belirtmek için sütunları veya satırları etiketleyin, ardından plakayı silikon 96 oyuklu plaka kapağıyla gevşek bir şekilde kapatın.
2. Bozulma için tek tek solucanları 96 oyuklu plakaya aktarın.
   1. Geçirgenleştirilmiş solucanları, çanağı ~1 cm derinliğe kadar doldurmak için% 0.01 Triton X-100 (M9TX-01) ile desteklenmiş yeterli M9 solucan tamponu içeren küçük (35 veya 60 mm) bir Petri kabına dikkatlice taşıyın.
      NOT: Çok sayıda solucan mevcutsa, sıvı kalabalıklaşacağından ve solucanları tek tek pipetlemek zor olacağından numunenin tamamını aktarmak mümkün olmayabilir.
   2. Bir diseksiyon mikroskobu veya başka bir düşük büyütmeli cihaz kullanarak, tek tek solucanları 20 μL hacimlerde pipetleyin ve bu solucanları 96 oyuklu plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın.
      NOT: Sadece taze öldürülmüş solucanları hasat etmek en iyisidir. Sert, doğrusal şekilli solucanlardan kaçının, çünkü bu solucanlar bir süredir ölü olabilir. Normal kaba fizyolojiye ve sağlam bir bağırsağa sahip, kavisli veya S şeklinde solucanlar almaya çalışın.
   3. Her hacmi aktardıktan sonra seçilen solucanın gerçekten kuyuya atıldığından emin olun. Bunu yapmak için, Petri kabının açık bir alanından 20 μL M9TX-01'i pipetleyin ve tüm hacmi tekrar kaba bırakın; Bu normalde pipete yapışmışsa solucanı dışarı atacaktır. Solucan sıkışmışsa, kuyudan 20 μL çıkarın ve transferi tekrar deneyin.
   4. Tüm solucanlar aktarıldıktan sonra, 96 oyuklu plakayı piyasada bulunan esnek kağıt destekli bir sızdırmazlık filmi tabakasıyla (2 x 2 kare) örtün ve sızdırmazlık filminin kağıt destekli tarafının numune kuyucuklarına baktığından emin olun. Sızdırmazlık filmini çok ince germemeye dikkat edin, aksi takdirde daha sonra çıkarılması çok zor olacaktır.
   5. Silikon sızdırmazlık matını esnek sızdırmazlık filminin üzerine hafifçe yerleştirin; Bu sırada kapağı kuyulara bastırmayın.
   6. Plakayı 30-60 dakika soğuması için 4 °C'ye getirin. Bu, kesinti sırasında numunelere zarar verebilecek aşırı ısınmayı önleyecektir.
      NOT: Bu, protokoldeki bir kesme noktasıdır. Çoğu durumda, plaka taşlamadan önce 4°C'de 4 saate kadar bırakılabilir. Bakteri sayısını değiştireceğinden solucanları gece boyunca bırakmayın.
3. Solucan dokularını parçalamak ve bağırsak bakterilerini serbest bırakmak için 96 oyuklu plakaları bir doku bozucuya yükleyin.
   NOT: (İsteğe bağlı) Özetler için tek sayıda 96 oyuklu plaka kullanılıyorsa, devam etmeden önce bir karşı ağırlık hazırlamak gerekir. 96 oyuklu boş bir derin plaka kullanın ve kuyucukları ilk plaka ile aynı ağırlığa gelene kadar suyla doldurun.
   1. Bir sızdırmazlık oluşturmak için silikon sızdırmazlık matını kuyucuklara sıkıca bastırın ve kapağın plakanın tüm yüzeyi boyunca düz durduğundan emin olun.
      NOT: Esnek sızdırmazlık filmi gerildikten sonra çok kalınsa, silikon kapağı tüm kuyucuklarda düz duracak şekilde sabitlemek zor olacaktır. Bu, çalkalama sırasında yetersiz bir sızdırmazlık ve kuyudan kuyuya kirlenmeye neden olacaktır.
   2. 96 oyuklu plaka adaptörlerini kullanarak plakaları doku bozucuya sabitleyin. Plakaları 30 Hz'de 1 dakika çalkalayın, ardından plakaları 180° döndürün ve tekrar 1 dakika çalkalayın. Bu, plakanın tüm kuyucuklarında eşit bir bozulma sağlanmasına yardımcı olacaktır.
   3. Esnek sızdırmazlık filmindeki kumları çıkarmak için plakaları tezgaha iki veya üç kez sıkıca vurun.
   4. İki adet 96 oyuklu plaka adaptörlü büyük bir santrifüj kullanarak, tüm malzemeyi kuyucukların dibine toplamak için plakaları 2400 x g'da 2 dakika boyunca döndürün.
   5. Silikon kapağı çıkarın ve esnek sızdırmazlık filmini dikkatlice çekin.
      NOT: Esnek sızdırmazlık filmi kuyucuklardan herhangi birine yapışırsa, çıkarmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanın. Bu, esnek sızdırmazlık filmi çok ince gerildiğinde yaygındır.
4. Solucan sindirim numunelerini 96 oyuklu plakalarda 300 μL'de seri olarak seyreltin.
   1. 200 μL'ye ayarlanmış çok kuyulu bir pipetleyici kullanarak, kuyucukların içeriğini yeniden karıştırmak için birkaç kez yavaş ve dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından mümkün olduğunca fazla sıvı çekin. Bu sıvıyı, bozulmuş solucan örneklerinin seri seyreltilmesi için hazırlanan 96 oyuklu plakaların üst sıralarına aktarın.
   2. 20 μL'ye ayarlanmış 96 oyuklu bir pipetleyici kullanarak, bu hacimdeki sıvıyı üst sıradan çıkarın ve B sırasına dağıtın. Karıştırmak için 8-10x yukarı ve aşağı pipetleyin. İpuçlarını atın.
   3. C satırında 0,01x seyreltme örnekleri oluşturmak için B satırındaki 0,1x örneklerinden başlayarak adım 4,2'yi tekrarlayın.
   4. C satırından D satırına giderek 4.2 adımını tekrarlayın.
   5. Bakteri ölçümü için katı agar üzerine plaka. Mono-kolonize solucanlar için, agar plakalarına her seyreltmeden [1x-0.001x] 10-20 μL damla koymak genellikle yeterlidir. Çoklu tür kolonizasyonu için, 10 cm'lik bir agar plakasına 100 μL pipetleyerek her seyreltmeyi ayrı ayrı plakalayın; cam kaplama boncukları kullanarak hemen yayın.

Malzemeler