$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kutupsal Lokalizasyonun ve Nokta/ICM Bileşenlerinin Dinamiğinin Ölçülmesi
NOT: Aşağıdaki adımlar, 2 x 2 gruplama ile elde edilen piksel başına 0,129 μm'lik görüntüler için tasarlanmıştır.
- sfGFP (süper klasör yeşil floresan proteini) füzyon proteinleri için polaritenin ölçülmesi (Şekil 1)
- Bakterilerin net bir şekilde görülebilmesi için görüntü kontrastını ayarlayın. Kutuptan başlayıp sitoplazmaya uzanan 0,25 x 1,3μm2 dikdörtgen yerleştirmek için bölge aracını kullanın. Dikdörtgen tam olarak bakteri sınırları içinde kalmalıdır.
- En az 200 bakteri işaretleyin ve ilgilendiğiniz bölgeler için maskeler oluşturmak üzere Maskelenecek Bölge düğmesini kullanın. Maske İstatistikleri ve Maske Kapsamı'nın altında Nesne'yi seçin. Ardından, Özellikler ve Yoğunluk altında, Ortalama Yoğunluk ve Varyans 'ı işaretleyin.
- Verileri dışa aktarın ve her bakterinin polarite puanlarını, varyans ile ortalama yoğunluk arasındaki oran olarak hesaplayın.
- Yüksek verimli uygulamalar için, faz ve 488 nm kanallarla görüntüler elde etmek için bir faz objektifi ve uygun bir yoğunlaştırıcı kurulumu kullanın. Bakterilerin tamamen ayrıldığı görüş alanlarını seçtiğinizden emin olun.
- Görüntünün faz kanalı kontrastını bakterilerin açıkça görülebileceği bir seviyeye ayarlayın. Çift kanallı görüntüyü açın, Segment Maskesi Oluştur penceresini başlatın ve kanalı faz olarak değiştirin.
- Uygun bir eşik ayarlayın ve Nesneleri Tanımla düğmesiyle küçük nesneleri kaldırın. Maskeyi İyileştir'in altında, Kenar Nesnelerini Kaldır'ı seçin ve daha sonra birbirine bitişik bakteri maskelerini ayırın.
- Daha önce 1.1.2–1.1.3 adımlarında açıklandığı gibi her hücre için 488 kanalındaki sinyalin polarite puanlarını hesaplayın.
- sfGFP füzyon proteinleri için dinamiklerin nicelleştirilmesi (Şekil 2)
NOT: Dinamikler, zaman içinde yoğunluktaki değişiklikler olarak tanımlanır ve aşağıdaki adımlar kısa görüntüleme süreleri (yani birkaç dakika) için tasarlanmıştır. Daha uzun görüntüleme süreleri isteniyorsa pede uygun takviyeleri ekleyin.- Görüntü Yakalama penceresinde Zaman Atlamalı seçeneğini işaretleyin, aralık kutusuna aralıkların zamanını girin ve # Zaman Noktası kutusuna 2 girin. İlgilenilen floresan proteini ifade eden Legionella pneumophila'nın art arda iki görüntüsünü elde edin.
- Hücreler açıkça görünene kadar görüntü kontrastını ayarlayın. Üç farklı maske yerleştirmek için Şekil 2A'yı ve aşağıdaki açıklamaları izleyin. En az 400 hücrenin ortasına 0,25 x 0,25 μm boyutunda bir kare yerleştirmek için bölge aracını kullanın.
- İlgilenilen karelerden bir maske (maske 1) oluşturmak için Maskelenecek Bölge düğmesini kullanın. Yeni bir boş maske (maske 2) oluşturun ve floresan ağartmayı hesaplamak için kullanılacak en az 25 rastgele hücrenin tüm hücre alanını işaretlemek için piksel aracını veya çokgen aracını kullanın. Yeni bir boş maske (maske 3) oluşturun ve arka plan çıkarma için kullanılacak hücreler arasındaki alanları işaretlemek için büyük fırça aracını kullanın.
- Maske İstatistikleri ve Maske Kapsamı altında, maske 1 ve maske 2 için Nesne'yi seçin. Ardından, Özellikler ve Yoğunluk altında Ortalama Yoğunluk'u seçin ve iki maskenin verilerini dışa aktarın. Maske 3 için, tüm maskenin ortalama yoğunluğunu dışa aktarın.
- Aşağıdaki formülleri kullanarak maske 1'deki her nesne için floresan yoğunluğundaki değişikliği hesaplayın:
Maske 1'in hücre merkezine yerleştirilmiş 0,25 μm × 0,25 μm'lik bir kare olduğu durumlarda, maske 2 tüm hücreyi kaplar, maske 3 hücreler arasındaki arka plandır, T1 ilk zaman noktasındaki ortalama yoğunluktur ve T2 ikinci zaman noktasındaki ortalama yoğunluktur.
