Legionella pneumophila'nın Kriyojenik Elektron Tomografisi için Hazırlanması

Özet

Kaynak: Chetrit, D., ve diğerleri. Legionella pneumophila nokta/icm salgı sisteminin uzay-zamansal özelliklerini çözmek için canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisinin uygulanması. J. Vis. Uzm. (2020)

Videoda bakteri kültürü, altın nanopartikül işaretleme ve vitrifikasyon teknikleri birleştirilerek kriyo-elektron tomografisi için Legionella pneumophila örneklerinin nasıl hazırlanacağı anlatılmaktadır. İşlem, doğal hücresel yapıları korur ve zarla ilişkili salgı sistemi bileşenlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Protokol

1. Cryo-ET ile sfGFP Kütle Yoğunluğunun Tespiti

1. Numune hazırlama, veri toplama ve yeniden yapılandırma

1. 37 °C'de 48 saat boyunca CYE-agar-streptomisin plakaları üzerinde floresan etiketli bir Dot/Icm proteini eksprese eden ağır bir Legionella pneumophila yaması büyütün. Hücreleri ddH₂O'da 0.7'lik bir OD_600'e yeniden süspanse edin. 20 μL hücre süspansiyonuna 5 μL kolloidal altın parçacıkları (BSA Tracer, 10 nm) ekleyin.

2. Hücre karışımının 5 μL'sini yeni parıldayan delikli bir karbon ızgaraya (Cu 200 ağ üzerinde R 2/1) pipetleyin ve 1 dakika bekletin. Filtre kağıdı ile kurulayın ve yerçekimi tahrikli bir piston aparatı kullanarak sıvı etan içinde dondurun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 nm kolloidal altın parçacıkları	Aurion	25486
100x Plan Apo hedefi (1,4 NA)	Nikon
ACE	Sigma-Aldrich	A9758 Serisi
CoolSNAP EZ 20 MHz dijital monokrom kamera	Fotometri
Gen Çerçevesi, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Bilimsel	AB-0578 Serisi
Holey Karbon ızgara R 2/1 Cu 200 ağ	Folyo	Q225-CR1
Demir(III) nitrat nonahidrat	Sigma-Aldrich	216828
Cryo-EM için K2 Summit kamera	GALİTAN
Mikroskop kapak slaytları 22x22 mm	Fisher Bilimsel	12-542B
Mikroskop kapak slaytları 24x50 mm	Fisher Bilimsel	12-545K
Mikroskop lamları 25x75x1 mm	Küre Bilimsel	1380
Slayt Kitabı 6.0	Akıllı Görüntüleme Yenilikleri
Spectra X hafif motor	Lümenkor