Hızla Büyüyen Bakteri Vibrio natriegens'in Kültürlenmesi

Özet

Kaynak: Wiegand, D.J., Lee, ve diğerleri, Hızla Büyüyen Bakteri Vibrio natriegens Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, ham ekstrakt üretimi için bakteri peletleri hazırlamak üzere hızlı büyüyen bir bakteri olan Vibrio natriegens'in havalandırılmış koşullar altında yetiştirilmesini ve hasat edilmesini göstermektedir.

Protokol

Vibrio natriegens Ham Hücre Ekstraktının Hazırlanması – Bakteri Kültürü

1. V. natriegens bakteri üreme ortamı LB-V2'yi (V2 tuzları ile lizojeni suyu) Tablo 1'e göre hazırlayın. Büyüme ortamını otoklavlayarak sterilize edin. Ortamın oda sıcaklığına (RT) ulaşmasını bekleyin. Fazla medyayı RT'de saklayın.
   DİKKAT: Otoklavı çalıştırırken uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin ve laboratuvara özel talimatlara bakın.
2. 3 mL LB-V2 ortamını aşılamak için vahşi tip V. natriegens'ten oluşan bir gliserol stoğu kullanın. 225 rpm'de çalkalayarak 30 °C'de gece boyunca büyütün.
3. 1 mL gece kültürünü 10.600 x g'da 1 dakika boyunca tezgah üstü santrifüjde santrifüjleyerek yıkayın. Elde edilen peleti bozmadan süpernatanı aspire edin ve 1 mL taze LB-V2 ortamında yeniden süspanse edin.
4. Steril kapaklı otoklavlanmış 4 L'lik şaşkın Erlenmeyer şişesine 1 L taze LB-V2 büyütme ortamı ekleyin. 1 mL yıkanmış gece kültürü (1:1.000 seyreltme oranı) kullanarak aşılayın. 225 rpm'de çalkalarken 30 °C'de kültür yetiştirin.
   NOT: V. natriegens kültürleri, 1:1.000 seyreltme oranı korunurken büyütülebilir veya küçültülebilir. Örneğin, steril kapaklı 2 L'lik şaşkın bir Erlenmeyer şişesinde 250 mL taze LB-V2 büyüme ortamına 250 μL yıkanmış gece kültürü ekleyin.
5. Bir spektrofotometre kullanarak kültürün OD_600'ünü izleyin. Kültür OD₆₀₀ = 1.0 ± 0.2'ye ulaştığında, kültürü 4 °C'de 20 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüjleme yoluyla hasat edin. Pelet buz üzerine yerleştirin.
   NOT: V. natriegens hızla büyür, bu nedenle kültürün yakından izlenmesi gereklidir. OD₆₀₀ = 1.0'a büyüme, 1:1.000 seyreltme oranında yaklaşık 1.5−2 saat sürmelidir.
6. Süpernatanı aspire edin ve elde edilen bakteri peletini hemen -80 °C'de saklayın veya doğrudan hücre lizizine geçin.
   NOT: Bu adım iyi bir durma noktasıdır; ancak, en iyi sonuçlar için peletin hemen veya 1-2 gün içinde işlenmesi önerilir.

Tablo 1: 1 L LB-V2 bakteri üreme ortamının hazırlanması için reaktifler

Tablo 1 A	LB-V2 Bakteriyel Büyüme Besiyerinin Hazırlanması
Parça	Miktar (g)	Nihai Konsantrasyon (mM)	Son Cilt (L)
LB Et Suyu (Miller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kartal	0.31	4.2
Tablo 1 B	S30A Lizis Tamponunun Hazırlanması
Parça	Miktar (g)	Nihai Konsantrasyon (mM)	Son Cilt (L)
Tris çözeltisi (pH 8.0) - 1 m (mL)	25	50	0.5
Mg-glutamat	2.72	14
K-glutamat	6.10	60
Ditiyotreitol (DTT) - 1 M (mL)	1	2

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2 mL Tüpler	Eppendorf Belediyesi	22363352
HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit)	Sigma	H3375 Serisi
LB (Luria-Bertani) Et Suyu (Miller)	Sigma	L3522 Serisi
Magnezyum klorür (MgCl₂)	Sigma	M8266 Serisi
Potasyum klorür (KCl)	Sigma	P9333
Sodyum klorür (NaCl)	Sigma	S7653 Serisi
Tris çözeltisi (pH 8.0) - 1 m	Davetli	AM9856 Serisi
Vibrio natriegens (Vahşi tip) Liyofilize Stok	ATCC	14048