Vibrio natriegens'ten Ham Hücre Ekstraktının Hazırlanması

Özet

Kaynak: Wiegand, D.J., ve diğerleri. Hızla Büyüyen Bakteri Vibrio natriegens Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, yüksek protein sentez hızıyla bilinen, hızla büyüyen bir bakteri olan Vibrio natriegens'ten bir hücre ekstraktının hazırlanmasını göstermektedir. Bakteri peleti, hücresel bozulmayı önlemek için buz üzerinde sonikasyondan önce lizis tamponunda yıkanır ve yeniden süspanse edilir. Lizat, çözünmeyen hücre kalıntılarını ayırmak için santrifüjlenir ve hücre özütü toplanır, flaşla dondurulur ve ileride kullanılmak üzere saklanır.

Protokol

1. V. natriegens Ham Hücre Ekstraktlarının Hazırlanması – Bakteri Kültürü

1. Tablo 1'e göre V. natriegens bakteriyel büyüme ortamı, lizojeni suyu versiyon 2'yi (LB-V2) hazırlayın. Büyüme ortamını otoklavlayarak sterilize edin. Ortamın oda sıcaklığına (RT) ulaşmasını bekleyin. Fazla medyayı RT'de saklayın.
   DİKKAT: Otoklavı çalıştırırken uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin ve laboratuvara özel talimatlara bakın.
2. 3 mL LB-V2 ortamını aşılamak için vahşi tip V. natriegens'ten oluşan bir gliserol stoğu kullanın. 225 rpm'de çalkalayarak 30 °C'de gece boyunca büyütün.
3. 1 mL gece kültürünü 10.600 x g'da 1 dakika boyunca tezgah üstü santrifüjde santrifüjleyerek yıkayın. Elde edilen peleti bozmadan süpernatanı aspire edin ve 1 mL taze LB-V2 ortamında yeniden süspanse edin.
4. Steril kapaklı otoklavlanmış 4 L'lik şaşkın Erlenmeyer şişesine 1 L taze LB-V2 büyüme ortamı ekleyin. 1 mL yıkanmış gece kültürü (1:1.000 seyreltme oranı) kullanarak aşılayın. 225 rpm'de çalkalarken 30 °C'de kültür yetiştirin.
   NOT: V. natriegens kültürleri, 1:1.000 seyreltme oranı korunurken büyütülebilir veya küçültülebilir. Örneğin, steril kapaklı 2 L'lik şaşkın bir Erlenmeyer şişesinde 250 mL taze LB-V2 büyüme ortamına 250 μL yıkanmış gece kültürü ekleyin.
5. Bir spektrofotometre kullanarak kültürün OD_600'ünü izleyin. Kültür OD₆₀₀ = 1.0 ± 0.2'ye ulaştığında, kültürü 4 °C'de 20 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüjleme yoluyla hasat edin. Pelet buz üzerine koyun.
   NOT: V. natriegens hızla büyür, bu nedenle kültürün yakından izlenmesi gereklidir. OD₆₀₀ = 1.0'a büyüme, 1:1.000 seyreltme oranında yaklaşık 1.5−2 saat sürmelidir.
6. Süpernatanı aspire edin ve elde edilen bakteri peletini hemen -80 °C'de saklayın veya doğrudan bölüm 2'de açıklanan hücre lizizine geçin.
   NOT: Bu adım iyi bir durma noktasıdır; ancak, en iyi sonuçlar için peletin hemen veya 1-2 gün içinde işlenmesi önerilir.

2. V. natriegens Ham Hücre Ekstraktlarının Hazırlanması – Hücre Lizizi

1. S30 lizis tamponunu steril deiyonize (DI) suda Tablo 1'e göre hazırlayın ve buzlu asetik asit kullanarak pH'ı 7.7'ye ayarlayın.
   DİKKAT: Buzlu asetik asit, pH'ı ayarlarken uygun KKD ile kullanılmalıdır.
2. Hücre lizis prosedürüne başlamadan önce S30 lizis tamponunu bir buzdolabında veya buz üzerinde yaklaşık 4 ° C'ye soğutun.
   NOT: Hızlı bir soğuma için lizis tamponu -20 °C'ye yerleştirilebilir. Arabelleğin donmasına izin vermeyin.
3. Hücre peletlerini 10−20 dakika veya tamamen eriyene kadar buzun üzerine yerleştirin. 10 mL soğuk S30 lizis tamponu kullanarak aynı 1 L kültürden elde edilen tüm peletleri yeniden süspanse edin, ardından süspansiyonu 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Peletler adım 1.6'da -80 °C'de dondurucuda dondurulmazsa, doğrudan yeniden süspansiyona geçin.
   NOT: Peletleri başlangıçta gerektiği gibi yeniden süspanse etmek için kullanılan S30 lizis tamponunun hacmini artırın.
4. 4 °C'de 10 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüj süspansiyonu. Peleti bozmadan süpernatanı aspire edin. Peleti 10 mL soğuk S30 lizis tamponu kullanarak ikinci kez yıkayın. Peletleri buzun üzerine yerleştirin.
5. Soğuk bir odada, 50 mL'lik tüpteki pelete 500 μL soğuk S30 lizis tamponu ekleyin. Geniş çaplı bir pipet ucu kullanarak peleti yeniden süspanse edin ve tüm pelet süspansiyonunu dikkatlice 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
   NOT: Geniş çaplı bir pipet mevcut değilse, pelet transferi için deliği artırmak amacıyla 1 mL'lik pipet ucunun ucunu kesmek için bir makas kullanın.
   1. Hacmi önemli ölçüde artırmadan mümkün olduğunca fazla pelet aktarın; bununla birlikte, pelet, 2 mL'lik tüpte homojen bir süspansiyon ile gösterildiği gibi, sonikasyona yetecek kadar sıvı içinde yeniden süspanse edilmelidir. 2 mL'lik tüpü aşırı doldurmayın. Süspansiyon 1,5 mL'yi geçmemelidir; gerekirse birden fazla tüpe bölün.
6. Hücre peletini buz üzerinde tutun ve soğuk bir odada çalışın. 600 mL'lik bir beheri buzla doldurun ve buzun üzerine 2 mL'lik bir tüp tutucu yerleştirin.
   NOT: Tüp tutucuyu beherin kenarına yakın bir yere yerleştirmek yararlıdır, böylece pelet süspansiyonu sonikasyon ilerlemesini izlemek için buzda görünür olacaktır (bkz. Şekil 1).
7. Hücreleri homojenize etmek için 2 mL'lik bir tüpte kısa süreliğine vorteks asılı peleti karıştırın, kapağın altındaki hücreleri çıkarmak için tüpleri hafifçe vurun ve kapak açıkken tüp tutucuya yerleştirin. Sonikatör ucunu, sıvı yüzeyinin hemen altında olacak şekilde süspansiyonun içine indirin.
8. Sonikasyon kurulumunu Şekil 2'de gösterildiği gibi bir sonikatör ve 1/8 inç uç çapına sahip bir prob kullanarak hazırlayın. Sonikatör kontrolüne aşağıdaki ayarları girin: 20 kHz frekans ve %50 amplitüd, darbe AÇIK süresi: 10 s, darbe KAPALI süresi: 60 s.
9. Darbe sonikasyon protokolünü üç döngü için çalıştırın. Pelet süspansiyonunun toplam hacmi > 500 μL ise, darbe sonikasyon protokolünü altı kez çalıştırın.
   NOT: Genel olarak, V. natriegens peletlerini parçalamak için 3−6 darbe yeterlidir; Sonikatöre bağlı olarak ek darbeler gerekebilir. Sonikasyon sırasında, tüpün dibine yerleşmiş olabilecek herhangi bir peleti parçalamak için probu yukarı ve aşağı hareket ettirmek için ayar düğmesi platformunu kullanın. Tüp tutucudan çıkarılabilir ve darbeler arasındaki süspansiyonu yeniden homojenleştirmek için kısa bir süre vortekslenebilir.
   DİKKAT: Sonikatör aktifken uygun işitme koruması kullanın.
10. Sonikasyonun ardından, ham hücre ekstraktını 4 ° C'de 30−45 dakika boyunca veya Şekil 3'te gösterildiği gibi lizat herhangi bir hücresel kalıntıdan arınmış olana kadar 16.000 x g'da santrifüjleyin.
11. Soğuk bir odada, elde edilen süpernatanların 50 μL'sini peleti bozmadan yeni 2 mL'lik tüplere ayırın.
    NOT: Yanlışlıkla yeni 2 mL'lik tüplere aktarılan herhangi bir kalıntı, ekstraktın yüksek verimli protein sentezi kapasitesini büyük ölçüde azaltacaktır.
12. Şekil 4'te gösterildiği gibi, tüpleri bir daldırma ipi takılı bir tüp tutucuya yerleştirerek ham hücre ekstraktlarını flaş dondurun. Tüpleri sıvı nitrojen içeren bir Dewar'a daldırın ve kullanıma kadar hemen -80 °C'de bir dondurucuya koyun. DİKKAT: Laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük, yüz siperi, kriyojen önlük ve eldivenler dahil olmak üzere sıvı nitrojeni işlemek için uygun KKD kullanın.

Tablo 1: 1 L LB-V2 bakteri üreme ortamı ve 0,5 L S30A hücre lizis tamponunun hazırlanması için reaktifler.

Tablo 1 A	LB-V2 Bakteriyel Büyüme Besiyerinin Hazırlanması
Parça	Miktar (g)	Nihai Konsantrasyon (mM)	Son Cilt (L)
LB Et Suyu (Miller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kartal	0.31	4.2
Tablo 1 B	S30A Lizis Tamponunun Hazırlanması
Parça	Miktar (g)	Nihai Konsantrasyon (mM)	Son Cilt (L)
Tris çözeltisi (pH 8,0) - 1 m (mL)*	25	50	0.5
Mg-glutamat	2.72	14
K-glutamat	6.10	60
Ditiyotreitol (DTT) - 1 M (mL)*	1	2

Sonuçlar

Şekil 1: Sonikasyon platformundaki beher ve tüp tutucunun yakından görünümü.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL Tüpler	Corning	352196
2 mL Tüpler	Eppendorf Belediyesi	22363352
50 mL Tüpler	Corning	352070
Dewar Matara - 4L	Termo Bilimsel	10-194-100C
L-Glutamik asit hemimagnezyum tuzu tetrahidrat	Sigma	49605
L-Glutamik asit potasyum tuzu monohidrat	Sigma	G1149 Serisi
LB Et Suyu (Miller)	Sigma	L3522 Serisi
Magnezyum klorür (MgCl₂)	Sigma	M8266 Serisi
Potasyum klorür (KCl)	Sigma	P9333
Potasyum hidroksit Peletleri	Sigma/Roche	1050121000
Q125 Sonikatör ve CL-18 probu	Qsonica	4422
Sodyum klorür (NaCl)	Sigma	S7653 Serisi
Vibrio natriegens (Vahşi tip) Liyofilize Stok	ATCC	14048