Bakteriyel Ham Hücre Ekstraktı Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu

Özet

Kaynak: Wiegand, D.J., ve diğerleri. Hızla Büyüyen Bakteri Vibrio natriegens Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, birleştirilmiş in vitro transkripsiyon ve translasyon gerçekleştirmek için Vibrio natriegens ham lizatına dayalı bakteriyel hücresiz bir protein ekspresyon sisteminin kullanımını göstermektedir. Temel bileşenlerle bir ana karışımın hazırlanmasını ve bir DNA şablonundan fonksiyonel proteinlerin adım adım sentezini vurgular.

Protokol

1. Hücresiz Reaksiyon Bileşenlerinin Hazırlanması

1. Genel reaksiyon bileşenleri
   1. Sırasıyla 100 mM ve 2000 mM konsantrasyonlarda steril DI (deiyonize edilmiş) su ile 50 mL'lik tüplerde Mg-glutamat ve K-glutamat çalışma stokları hazırlayın.
   2. 250 mL'lik bir behere 100 mL steril DI su ekleyerek %50 (a/h) polietilen glikol (PEG)-8000'den oluşan bir çalışma stoğu hazırlayın. Behere küçük bir manyetik karıştırıcı yerleştirin. 50 g PEG-8000'i tartın ve beherdeki 100 mL suya ekleyin.
   3. Beheri 100 °C'ye ayarlanmış ısıtılmış bir karıştırma plakasına yerleştirin ve PEG-8000 çözeltiye girene kadar 250 rpm'de karıştırın. 50 mL'lik tüplere aktarmadan önce PEG-8000 sıvı karışımının soğumasını bekleyin.
2. Enerji çözümü ana karışımı
   1. 500 mL steril DI suya 140 g KOH peletleri ekleyerek 5 M'lik bir KOH çözeltisi hazırlayın.
      DİKKAT: Bu solüsyonu kimyasal bir başlıkta hazırlayın ve güçlü bazlarla çalışırken KKD giyin. Çözelti ısınacaktır, bu nedenle basınç oluşumunu önlemek için şişe kapağı gevşek olmalıdır. Kullanmadan önce KOH çözümünün RT'ye ulaşmasını bekleyin.
   2. 100 mL'lik bir şişeye 20.85 g HEPES ekleyerek 1750 mM HEPES-KOH tamponu hazırlayın. Hacim 40 mL'ye ulaşana kadar yavaşça steril DI suyu ekleyin. HEPES'i çözmek için girdap şişesi. pH'ı 8,0'a ayarlamak için 5 M KOH çözeltisini kullanın ve ardından çözelti hacmini 50 mL'ye getirin.
      DİKKAT: KOH, pH ayarlanırken uygun KKD ile kullanılmalıdır.
   3. Kalan 10x enerji ana karışım stok bileşenini Tablo 1'de belirtilen konsantrasyonlarda steril DI suyunda hazırlayın ve her bir stoğu buz üzerine yerleştirin. 100 mM ATP, GTP, CTP ve UTP stoklarını RT'de çözün ve buz üzerine koyun.
      NOT: Gerekirse reaktifleri çözelti içinde çözmek için 37 °C ve 350 rpm'ye ayarlanmış bir termomikser kullanılabilir. Reaktifleri aşırı ısıtmayın veya termomikser üzerinde uzun süre bırakmayın.
   4. 15 mL'lik bir tüpe, her bir enerji çözeltisi ana karışım bileşenini Tablo 1'de belirtilen sıra ve hacme göre ekleyin. Her bileşen eklendikten sonra çözeltiyi vorteksleyin. Bu, 5 mL 10x enerji çözeltisi ana karışımı yapacaktır.
   5. 10x enerji çözeltisi ana karışımını 2 mL'lik tüplerde 200 μL'lik alikotlara bölün. Her alikot hızlı dondurun. Kullanana kadar hemen -80 °C'lik dondurucuya koyun.
3. Amino asit ana karışımı
   1. Taze bir 4x amino asit ana karışımı hazırlamak için, her bir amino asit stoğunu RT'de çözerek ve ardından her birini buzun üzerine yerleştirerek başlayın. Tüm amino asit stoklarının tamamen çözündüğünden emin olmak için 37 °C ve 350 rpm'ye ayarlanmış bir vorteks ve/veya termomikser kullanın.
      NOT: Sistein tamamen çözülmeyebilir; Amino asit ana karışımına süspansiyon olarak eklenebilir. Reaktifleri aşırı ısıtmayın veya termomikser üzerinde uzun süre bırakmayın.
   2. 15 mL'lik bir tüpte, steril DI suyuna uygun hacimde amino asit ekleyin, böylece her birinin nihai konsantrasyonu aşağıdaki sırayla 8 mM olur: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU ve CYS. Her amino asidi ekledikten sonra, ana karışım çözeltisini vorteksleyin. Tablo 1'de listelenen hacimler, 2.4 mL amino asit ana karışımını oluşturacaktır.
   3. 4x amino asit ana karışımını 2 mL'lik tüplerde 200 μL'lik alikotlara bölün. Her alikot hızlı dondurun. Kullanana kadar hemen -80 °C'de bir dondurucuya koyun.
4. Reaksiyona hazır plazmit DNA şablonunun üretimi
   NOT: Bu sistemdeki hücresiz protein ekspresyonu, süper klasör yeşil floresan protein (GFP) ekspresyon vektörü T7-pJL1-sfGFP (Malzeme Tablosu) kullanılarak optimize edilmiştir. Bu plazmidin hücresiz reaksiyon verimliliği için bir kontrol olarak ve diğer protein dizilerinin klonlanması ve ekspresyonu için pJL1 omurgası olarak kullanılması önerilir. Diğer plazmit DNA şablonları kullanılabilir; bununla birlikte, transkripsiyonun bir T7 promotör dizisi ve T7 RNA polimerazın varlığı tarafından kontrol edildiğine dikkat etmek önemlidir. Dönüştürülmüş E. coli'den herhangi bir plazmit DNA şablonunun büyük ölçekli üretimi için basit bir protokol aşağıda açıklanmıştır.
   1. İstenilen vektörü, üreticinin talimatlarına göre bir plazmit saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın (Malzeme Tablosu). NOT: Hücresiz reaksiyonun sıkı hacim kısıtlamalarını karşılamak için plazmit DNA şablonunun mümkün olduğunca konsantre edilmesi önerilir. Genel olarak, 750−1500 ng/μL'lik bir çalışma stoğu hedefleyin.

2. V. natriegens Ham Ekstraktı Kullanarak Hücresiz Protein Ekspresyon Reaksiyonlarının Gerçekleştirilmesi

1. Plazmit veya lineer DNA şablonu kullanılarak hücresiz protein ekspresyonu
   1. -80 °C'lik dondurucudan 10x enerji çözeltisi ana karışımını ve 4x amino asit ana karışımı alikotunu çıkarın, RT'de çözün ve buzun üzerine koyun. T7 RNA polimeraz ve RNaz inhibitör stoklarını -20 °C dondurucudan çıkarın ve buz üzerine koyun. DNA şablonunu RT'de çözün ve buzun üzerine yerleştirin.
   2. Her bir bileşeni buz üzerinde 2 mL'lik bir tüpe aşağıdaki sırayla ekleyerek Tablo 2'ye göre hücresiz bir reaksiyon ana karışımı hazırlayın: amino asit ana karışımı, enerji çözeltisi ana karışımı, Mg-glutamat, K-glutamat, DNA şablonu, PEG-8000, T7 RNA polimeraz ve RNaz inhibitörü. Ana karışıma her eklemeden sonra tüpü hafifçe vurun.
      NOT: Hücresiz protein ekspresyonu için doğrusal bir şablon kullanılacaksa, kayda değer protein verimi elde etmek için plazmit şablonuna kıyasla 5−10 kat daha fazla malzeme ekleyin.
   3. V. natriegens ham hücre lizatını -80 °C'lik donduruculardan çıkarın ve çözülene kadar 10−20 dakika buz üzerinde bekletin. Tablo 2'ye göre hücresiz reaksiyon ana karışımına uygun hacimde ham hücre ekstraktı ekleyin ve yukarı ve aşağı hafifçe vurarak veya pipetleyerek hafifçe karıştırın.
   4. Bir termocycler kullanarak uç nokta hücresiz protein ekspresyonu
      1. 10 μL hücresiz reaksiyon ana karışımını 96 veya 384 oyuklu bir PCR plakasının dibine pipetleyin. PCR plakasına yapılan her transfer arasında, tüpü hafifçe vurarak ana karışımı karıştırın.
         NOT: Tüm numunelerde reaksiyon tekrarlanabilirliğini ve hücresiz protein ekspresyonunu en üst düzeye çıkarmak için hücresiz reaksiyon ana karışımı her zaman iyice karıştırılmalıdır.
   5. Kuyucukların kenarlarına sıkışmış olabilecek herhangi bir ana karışımı bir araya getirmek için plakayı 10 saniye boyunca 1.000 x g'da kısaca santrifüjleyin. Buharlaşmayı önlemek için kuyucukları bir plaka yapıştırıcısı ile kapatın ve ardından PCR plakasını 105 °C'ye ayarlanmış ısıtılmış bir kapakla 26 °C'ye ayarlanmış bir termocycler'a yerleştirin.
      NOT: Bir termocycler'ın eşit ısı dağılımı ve ısıtılmış kapağı, protein ekspresyon verimini büyük ölçüde artırır.
   6. Hücresiz reaksiyonları en az 3 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, eksprese edilen proteinler saflaştırılabilir, miktarı belirlenebilir ve sonraki işlemler için kullanılabilir.
      NOT: Eksprese edilen proteinler, kullanıcının tercih ettiği bir yöntem kullanılarak hücresiz reaksiyonda doğrudan ölçülebilir. Örneğin, floresan proteinler, harici bir standart eğri kullanılarak ölçülebilir veya hücresiz reaksiyonda radyoetiketli bir amino asit kullanılıyorsa radyoaktivite ölçülebilir. UV-görünür spektroskopi veya toplam protein tahlilleri, ilk saflaştırma olmadan hücresiz reaksiyonlarda protein üretimini doğrudan ölçmek için genellikle önerilmez.

Tablo 1: 5 mL 10x enerji çözeltisi ana karışımının ve 2.4 mL 4x amino asit ana karışımının hazırlanması için reaktifler.

10x Enerji Çözeltisi Ana Karışımının Hazırlanması
Parça	Stok Konsantrasyonu (mM)	Nihai Konsantrasyon (mM)	Miktar (μL)	Son Hacim (μL)
HEPES-KOH pH 8	1750	500	1428.57	5000
ATP	100	15	750.00
GTP'nin	100	15	750.00
CTP'nin	100	9	450.00
UTP	100	9	450.00
E. coli MRE 600'den tRNA (mg/mL)*	100	2	100.00
Koenzim A Hidrat	200	2.6	65.00
NAD	200	3.3	82.50
kamp	650	7.5	57.69
Folinik asit	100	0.7	35.00
Spermidin	1600	10	31.25
3-PGA	2000	300	750.00
Steril Deiyonize Su			49.99
	4x Amino Asit Ana Karışımının Hazırlanması
Parça	Stok Konsantrasyonu (mM)	Nihai Konsantrasyon (mM)	Miktar (μL)	Son Hacim (μL)
ALA	168	8	114.3	2400
ARG	168	8	114.3
ÖSB	168	8	114.3
ASP	168	8	114.3
GLN	168	8	114.3
GLU	168	8	114.3
GLY	168	8	114.3
ONUN	168	8	114.3
YALAN	168	8	114.3
LYS	168	8	114.3
TANIŞ	168	8	114.3
PHE	168	8	114.3
LEHİNDE	168	8	114.3
SER	168	8	114.3
THR	168	8	114.3
VAL	168	8	114.3
TRP	168	8	114.3
TYR	168	8	114.3
LEU	140	8	137.1
CYS	168	8	114.3
Steril Deiyonize Su			91.4

Tablo 2: DNA şablonu için optimize edilmiş V. natriegens hücresiz reaksiyon ana karışımının bileşenleri

Hücresiz Reaksiyon Ana Karışımı
Parça	Stok Konsantrasyonu (mM)	Nihai Konsantrasyon (mM)	Miktar (μL) 1x Reaksiyon	Miktar (μL) 50x Reaksiyon
Çıkar (%)		25	2.50	125.00
Mg-glutamat	100	3.5	0.35	17.50
K-glutamat	2000	80	0.40	20.00
4x Amino Asit Ana Karışımı	8.0	2	2.50	125.00
10x Enerji Çözümü Ana Karışımı			1.00	50.00
Plazmit DNA (ng/μL)	1000	500	0.50	25.00
%50 PEG-8000 (%)	50	2	0.40	20.00
T7 RNA Polimeraz			1.00	50.00
RNaz İnhibitörü, Murin			0.10	5.00
Steril Deiyonize Su			1.25	62.50
Reaksiyon Hacmi (μL):	10

Malzemeler