Bakteriyel Ham Hücre Ekstraktı Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu

Özet

Kaynak: Wiegand, D.J., ve diğerleri. Hızla Büyüyen Bakteri Vibrio natriegens Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, birleştirilmiş in vitro transkripsiyon ve translasyon gerçekleştirmek için Vibrio natriegens ham lizatına dayalı bakteriyel hücresiz bir protein ekspresyon sisteminin kullanımını göstermektedir. Temel bileşenlerle bir ana karışımın hazırlanmasını ve bir DNA şablonundan fonksiyonel proteinlerin adım adım sentezini vurgular.

Protokol

1. Hücresiz Reaksiyon Bileşenlerinin Hazırlanması

1. Genel reaksiyon bileşenleri
   1. Sırasıyla 100 mM ve 2000 mM konsantrasyonlarda steril DI (deiyonize edilmiş) su ile 50 mL'lik tüplerde Mg-glutamat ve K-glutamat çalışma stokları hazırlayın.
   2. 250 mL'lik bir behere 100 mL steril DI su ekleyerek %50 (a/h) polietilen glikol (PEG)-8000'den oluşan bir çalışma stoğu hazırlayın. Behere küçük bir manyetik karıştırıcı yerleştirin. 50 g PEG-8000'i tartın ve beherdeki 100 mL suya ekleyin.
   3. Beheri 100 °C'ye ayarlanmış ısıtılmış bir karıştırma plakasına yerleştirin ve PEG-8000 çözeltiye girene kadar 250 rpm'de....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL Tüpler	Corning	352196
2 mL Tüpler	Eppendorf Belediyesi	22363352
384 kuyucuklu Siyah Test Plakaları	Corning	3544
384 oyuklu PCR Plakaları	Eppendorf Belediyesi	951020702
50 mL Tüpler	Corning	352070
96 oyuklu PCR Plakaları	Eppendorf Belediyesi	30129300
Adenozin 3',5'-siklik monofosfat sodyum tuzu monohidrat	Sigma	A6885 Serisi
Adenozin 5'-trifosfat - 100 mM	NEB	N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-kuyucuklu Termocycler	Termo Fisher	4388444
Test Plakası Yapıştırıcıları	BioRad	MSB1001
β-Nikotinamid adenin dinükleotid hidrat (NAD)	Sigma/Roche	10127965001
Koenzim A hidrat	Sigma	C4283 (İngilizce)
Sitidin 5'-trifosfat - 100 mM	NEB	N0450L
D-(-)-3-Fosfogliserik asit disodyum tuzu (3-PGA)	Sigma	P8877
Dewar Matara - 4L	Termo Bilimsel	10-194-100C
DL-Ditiyotreitol çözeltisi - 1 M	Sigma	42816
Folinik asit kalsiyum tuzu hidrat	Sigma	47612
Buzlu Asetik Asit	Sigma	A6283 Serisi
Guanozin 5'-trifosfat - 100 mM	NEB	N0450L
HEPES	Sigma	H3375 Serisi
L-Glutamik asit hemimagnezyum tuzu tetrahidrat	Sigma	49605
L-Glutamik asit potasyum tuzu monohidrat	Sigma	G1149 Serisi
Magnezyum klorür (MgCl₂)	Sigma	M8266 Serisi
Plazmit pJL1-sfGFP	Addgene	69496
Plazmid Plus Maxi kiti	Qiagen	12963
Poli(etilen glikol) (PEG)-8000	Sigma	89510
Potasyum klorür (KCl)	Sigma	P9333
Potasyum hidroksit Peletleri	Sigma/Roche	1050121000
RNaz İnhibitörü, Murin	NEB	M0314
RTS Amino Asit Örnekleyici	Biyoteknoloji tavşanı	BR1401801
Sodyum klorür (NaCl)	Sigma	S7653 Serisi
Spermidin	Sigma	S0266
T7 RNA Polimeraz	NEB	M0251 Serisi
Tris çözeltisi (pH 8.0) - 1 m	Davetli	AM9856 Serisi
E. coli MRE 600'den tRNA	Sigma/Roche	10109541001
Üridin 5'-trifosfat - 100 mM	NEB	N0450L
Vibrio natriegens (Vahşi tip) Liyofilize Stok	ATCC	14048