Mikroakışkan Mikrodamlacık Kültür Sistemi Kullanarak Bakteri Büyümesinin Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Özet

Kaynak: Jian, X. ve diğerleri, Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) Kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, bakteri üremesinin gerçek zamanlı izlenmesi için mikroakışkan damlacık tabanlı bir platformun kullanımını göstermektedir. Sistem, bakteriyel süspansiyonlar içeren tekdüze damlacıklar üreterek ve bunları bir algılama yolu boyunca yönlendirerek, bir büyüme eğrisi oluşturmak için hücre yoğunluğunun sürekli optik ölçümüne olanak tanır.

Protokol

1. Hazırlıklar

1. Şırınga iğnesini (iç çap 0,41 mm ve dış çap 0,71 mm'dir), hızlı bağlantı A'yı ve reaktif şişesini (Şekil 1C) bağlayın ve bunları 121 °C'de 15 dakika otoklavlayın.
   NOT: Sterilizasyon sırasında reaktif şişesinin kapağını hafifçe açın. Her seferinde kullanım için birkaç reaktif şişesi daha hazırlanabilir.
2. Mikrodamlacık kültür sistemi (MMC) yağını filtrelemek için 0,22 μm poliviniliden florür (PVDF) filtresi kullanın. Mikroakışkan çipi (Şekil 1B) ve MMC yağını önceden temiz tezgaha koyun ve kullanmadan önce 30 dakika ultraviyole ışınlama ile sterilize edin.
   NOT: Hızlı bağlantı A, reaktif şişesi, MMC yağı ve mikroakışkan çipin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın.
3. Mikroakışkan çipi takın
   1. Ameliyat odasının kapısını açın (Şekil 1A) ve fiber optik probu kaldırın.
   2. Elektrik alan deliklerini elektrik alan iğneleriyle hizalayın ve çipi yavaşça çip kaidesine yerleştirin. Ardından iki konumlandırma sütununu konumlandırma deliklerine yerleştirin ve fiber optik probu yere koyun (Şekil 1D).
   3. Çip üzerindeki hızlı konektör A'yı konum numarasına göre MMC'nin ilgili bağlantı noktasına bağlayın (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Ardından ameliyat odasının kapısını kapatın.
4. Yağ şişesindeki MMC yağını (yaklaşık 80 mL'ye kadar) doldurun ve kullanmadan önce atık şişesindeki atık sıvıyı boşaltın.
   NOT: Atık sıvı genellikle organik atıktır. Lütfen imha sırasında deney düzeneğine bağlı olarak değişikliğe tabi olan bölgesel yasa ve yönetmeliklere bakın.

2. MMC'de büyüme eğrisi ölçümü

1. İlk bakteri çözeltisi için hazırlık
   1. Luria-Bertani (LB) ortamını hazırlamak ve 121°C'de 15 dakika otoklav yapmak için ilgili standart yönetmeliklere uyun.
      NOT: LB ortamının bileşenleri: NaCl (10 g/L), maya özütü (5 g/L) ve tripton (10 g/L).
   2. Escherichia coli (E. coli) MG1655 suşunu gliserol stoğundan çıkarın ve çalkalayan bir inkübatörde (200 rpm) 37 °C'de 5-8 saat boyunca çalkalayan bir inkübatörde (200 rpm) 10 mL LB ortamı ile 50 mL'lik bir çalkalama şişesinde yetiştirin.
      NOT: Yetiştirme süresi spesifik türlere bağlıdır. Suşu logaritmik periyotta/fazda yetiştirmek en uygunudur.
   3. Kültürlenmiş E. coli MG1655 çözeltisini, bir başlangıç bakteri çözeltisi elde etmek için 600 nanometrede (OD₆₀₀) 0.05-0.1'lik bir optik yoğunluğa kadar taze ortamla seyreltin (yaklaşık 10 mL hazırlayın).
2. MMC'yi başlatmak için Başlatma'ya tıklayın. Başlatma arayüzü göründükten sonra, yetiştirme sıcaklığını 37 °C ve fotoelektrik sinyal değerini 0,6 olarak ayarlayın (Şekil 2A). Başlatma yaklaşık 20 dakika sürecektir.
3. Başlatma sırasında ultraviyole (UV) lambasını (dalga boyu 254 nm) açın.
4. İlk bakteri solüsyonunu ve MMC yağını reaktif şişesine enjekte edin.
   1. Temiz tezgahta sterilize edilmiş bir reaktif şişesi çıkarın ve kapağı sıkın.
   2. Yan tüpün şırınga iğnesinden 3-5 mL MMC yağı enjekte etmek için 10 mL'lik steril bir şırınga kullanın. Yağın iç duvara tamamen sızmasını sağlamak için reaktif şişesini yavaşça eğin ve döndürün.
   3. Yaklaşık 5 mL başlangıç bakteri solüsyonu enjekte edin ve ardından tekrar 5-7 mL yağ enjekte ederek reaktif şişesini doldurun.
   4. Bağımsız hızlı konektörü A'yı dışarı çekin ve numune enjeksiyon işlemini tamamlamak için reaktif şişesinin hızlı konektörünü A hızlı konektörü B'ye takın (Şekil 3A).
5. Başlatmanın bitmesini bekleyin ve ardından UV lambasını kapatın (dalga boyu 254 nm).
6. Operasyon odasının kapısını açın ve reaktif şişesini metal banyoya koyun.
7. Çipin C2 konektörünü ve reaktif şişesinin hızlı konektörünü A dışarı çekin. Reaktif şişesinin yan tüp konnektörünü C2 konnektörüne ve üst tüp konnektörünü O2 konnektörüne bağlayın. Ardından ameliyat odasının kapısını kapatın.
8. Büyüme eğrisi ölçümünün işlevini seçmek için Büyüme Eğrisi'ne tıklayın (Şekil 2A). Parametre ayar arayüzünde, Sayıyı 15 olarak girin, OD algılama anahtarını açın ve Dalga Boyunu 600 nm olarak ayarlayın. Damlacık üretimini başlatmak için Başlat'a tıklayın. Yaklaşık 10 dakika sürecektir. NOT: Burada Sayı , üretilecek damlacıkların sayısını ifade eder. Dalga boyu , tespit edilecek OD'nin dalga boyunu ifade eder. Sayıyı (maksimum 200) ve Dalga Boyunu (350-800 nm) deney gereksinimlerine göre ayarlayın.
9. Ana arayüzde "C2 ve O2 arasındaki reaktif şişesini çıkarın, ardından tamamlandıktan sonra lütfen Tamam düğmesine tıklayın" uyarısında bulunan bir açılır pencere göründüğünde, reaktif şişesini çıkarmak için operasyon odasının kapısını açın ve C2 ve O2 konektörlerini bağlayın.
10. Kapıyı kapatın ve OK Damlacıkları otomatik olarak geliştirmek ve OD değerlerini algılamak için açılır penceredeki düğmesine basın.
    NOT: MMC, damlacık fiber optik probu geçtiğinde OD değerini algılar. Bu nedenle, tespit süresi üretilen damlacıkların sayısına bağlıdır.
11. Büyüme eğrisi durağan aşamaya ulaştığında, Veri Dışa Aktarma OD verilerini dışa aktarmak için düğmesine basın. Veri kaydetme yolunu seçin ve yetiştirme döneminde kaydedilen OD değerini, uygun yazılım (örneğin, Microsoft Excel) tarafından açılabilen .csv formatında dışa aktarın. Ardından, büyüme eğrisini çizmek için bir haritalama yazılımı (örneğin, EXCEL ve Origin 9.0) kullanın.
    NOT: Yetiştirme işlemi sırasında, mevcut tüm damlacıkların OD verilerini dışa aktarmak için herhangi bir zamanda Veri Dışa Aktarma'ya tıklamak mümkündür.

Sonuçlar

Şekil 1: MMC'nin yapısı ve temel araçları. (A) MMC'nin dış ve operasyonel odası. (B) MMC'nin mikroakışkan çipi. Çipin yedi kanalı vardır (C1-C6 ve CF). (C) Reaktif şişesi. Bir üst borusu ve bir yan borusu vardır. Numuneyi reaktif şişesine enjekte etmeden ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,22 μm PVDF filtre membranı	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	MMC yağını sterilize edin
4 °C buzdolabı	Haier	BCD-289BSW	Reaktif depolama için
Agar	Becton, Dickinson ve Şirketi	214010	Katı plaka hazırlama için
Temiz tezgah	Pekin Donglian Har Enstrüman İmalatı Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	Aseptik çalışma ve UV sterilizasyonu için
Bilgisayar	Lenovo	E450 Serisi	Yazılım kurulumu ve MMC kontrolü
Sabit sıcaklık inkübatörü	Şangay qixin bilimsel alet co., LTD	LRH 250	Katı ortam kullanarak mikrobiyal yetiştirme için
Elektronik terazi	OHAUS	AR 3130 Serisi	Reaktif tartımı için
EP tüpü	Termo Balıkçı	1,5 milyon L	Damlacık toplama için
Dondurucu tüp	Termo Balıkçı	2,0 mL	Gerinim koruması için
Gliserol	GENEL REAKTİF	G66258A	Gerinim koruması için
Yüksek basınçlı buhar sterilizasyon kabı	SANYO Elektrik	MLS3020	Otoklavlanmış sterilizasyon için
Mikrobiyal mikrodamlacık kültür sistemi (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biyoteknoloji Co., Ltd.	MMC-I	Büyüme eğrisi belirleme ve adaptif evrim gerçekleştirme. Lütfen http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Mikroakışkan çip	Luoyang TMAXTREE Biyoteknoloji Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	Çeşitli damlacık işlemleri için. Lütfen http://www.tmaxtree.com/en/
MMC yağı	Luoyang TMAXTREE Biyoteknoloji Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	Damlacık mikroakışkanları için yağ fazı. Lütfen http://www.tmaxtree.com/en/
NaCl	GENEL REAKTİF	G81793J	LB ortamının bileşeni
Petri kabı	Corning Anonim Şirketi	90 mm	Katı ortamın hazırlanması için
Pipet	Eppendorf Hakkında	2,5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	Sıvı işleme için
Hızlı bağlantı A	Luoyang TMAXTREE Biyoteknoloji Co., Ltd.	—	Her eklemin bağlantısı için. Lütfen http://www.tmaxtree.com/en/
Reaktif şişesi	Luoyang TMAXTREE Biyoteknoloji Co., Ltd.	MMC-PCB	Bakteri çözeltisi ve reaktiflerinin örneklenmesi ve saklanması. Lütfen http://www.tmaxtree.com/en/
Şişeyi sallayın	Birlik-Biyoteknoloji	50 mL	Mikrobiyal yetiştirme için
Sallanan inkübatör	Şangay Sukun Sanayi A.Ş.	GÖKYÜZÜ-210 2B	Çalkalama şişesinde mikrobiyal yetiştirme için
Şırınga	JIANGSU ZHIYU TIBBI EĞITIM CO, LTD	10 milyon L	Sıvıyı çekin ve reaktif şişesine enjekte edin
Şırınga iğnesi	OUBEL Hırdavat Mağazası	22G	İç çap 0,41 mm ve dış çap 0,71 mm'dir.
Tripton	Oxoid Ltd.	LP0042 Serisi	LB ortamının bileşeni
Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabı	SANYO Ultra düşük	MDF-U4086S	Gerinim koruması için (-80 °C)
UV–Vis spektrofotometresi	General Electric Şirketi	Ultrospec 3100 pro	OD değerlerinin ölçümü için
Maya özü	Oxoid Ltd.	LP0021 Serisi	LB ortamının bileşeni