İpliksi Siyanobakteri Phormidium lacuna'da Doğal Dönüşüm ve GFP İfadesi

Özet

Kaynak: Weber, N., ve diğerleri, İpliksi Siyanobakteri Phormidium lacuna'nın Doğal Dönüşümü, Protein Ekspresyonu ve Kriyopkonservasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, homolog rekombinasyon yoluyla stabil GFP ekspresyonu ve antibiyotik direnci elde etmek için plazmit DNA kullanarak filamentli siyanobakterilerde doğal dönüşüm gerçekleştirmeye yönelik bir prosedürü açıklamaktadır.

Protokol

1. Doğal dönüşüm ve GFP ifadesi

NOT: Dönüşüm, Escherichia coli'de yayılan bir plazmit vektörüne dayanır (E. koli); omurga vektörleri olarak pGEM-T veya pUC19 kullanılabilir. Süper klasör yeşil floresan proteini (sfGFP) ekspresyonu için vektör örnekleri, temsili sonuçlar bölümünde açıklanmıştır.

1. Tüm adımları steril laboratuvar koşullarında (temiz tezgah, steril cam eşyalar) steril malzeme kullanarak gerçekleştirin.
2. 2 x 50 mL f/2 sıvı ortamı, çalışan bir kültürden 2 x 1 mL Phormidium lacuna (P. lacuna) filamentleri ile iki adet 250 mL'lik şişeye aşılayın. Beyaz ışıkta (50 μmol ^{m-2 s-1}) çalkalama altında (yatay dönüş, 50 rpm) 25 °C'de ~5 gün boyunca yetiştirin.
3. Üreticinin talimatlarına göre bir midi hazırlık kiti kullanarak ~200 μg transformasyon vektörü DNA'sı hazırlayın.
4. 100 mL P. lacuna hücre süspansiyonunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 10.000 rpm'de 3 dakika boyunca homojenize edin. OD'yi 750 nm'de ölçün (istenen değer = 0,35).
5. Hücre süspansiyonunu 6.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti kalan sıvının 800 μL'sinde (artık sıvı ve filamentler dahil toplam hacim) ve ilave f/2⁺ ortamında süspanse edin.
6. 120 μg/mL kanamisin içeren sekiz adet f/2⁺ bakto-agar plakası (10 cm çapında) alın. Her agar plakasının ortasına 10 μg DNA pipetleyin. Hemen her agar plakasının ortasına (DNA'nın üstüne) 100 μL hücre süspansiyonu pipetleyin.
7. Fazla sıvının buharlaşmasını sağlamak için agar plakasını kapaksız olarak temiz tezgahta tutun. Plakayı kapatın ve 25 gün boyunca 2 °C'de beyaz ışıkta yetiştirin.
8. Her agar plakasının filamentlerini bir aşılama halkası ile 120 μg/mL kanamisin içeren birkaç taze f/2⁺ bakto-agar plakasına dağıtın. Plakaları 25 °C'de beyaz ışıkta yetiştirin ve kültürleri düzenli olarak mikroskop altında kontrol edin.
9. Canlı, dönüştürülmüş filamentleri mikroskop altında 7-28 gün sonra tanımlayın. Diğer filamentlerden farklı olan sağlıklı, yeşil filamentler arayın (Şekil 1). Bu yeşil filamentler tanımlanabilirse, bir sonraki adıma geçin; aksi takdirde tabağı 7 gün daha saklayın.
10. Tanımlanan bu canlı filamentleri 250 μg/mL kanamisin içeren 50 mL sıvı f/2⁺ ortama aktarmak için forseps kullanın. Beyaz ışıkta 25 °C'de bir çalkalayıcıda (yatay dönüş, 50 rpm) yetiştirin. Dört haftaya kadar büyümeyi gözlemleyin.
11. Filamentleri 250 μg/mL kanamisin içeren agar ortamına geri aktarın ve filamentlerin büyümesini bekleyin. Birkaç gün sonra, tek filamentleri daha yüksek konsantrasyonda kanamisin içeren taze bir agar plakasına aktarın, örneğin 500 μg/mL. Orijinal plakayı saklayın.
12. Filamentlerin sıvı kültürde veya agarda yüksek konsantrasyonda kanamisin içinde çoğaltıldığından emin olun. Ayrışmayı hızlandırmak için kanamisin konsantrasyonunu tekrar artırın. NOT: Dönüştürülmüş P. lacuna 10.000 μg/mL'ye kadar kanamisin içinde büyür. Diğer türler bu kadar yüksek konsantrasyonlara tolerans göstermeyebilir.
13. GFP ekspresyonu için: 40x veya 63x'e ayarlanmış objektifin büyütmesinde bir floresan mikroskobu ile tek filamentleri gözlemleyin. Bir parlak alan iletim görüntüsü ve bir floresan görüntüsü yakalayın. GFP için aşağıdaki ayarları kullanın: Uyarma için 470 nm bant geçişi, emisyon için 525 nm bant geçişi ve 495 nm ışın ayırıcı, 500 ms'lik ilk maruz kalma süresi.
14. Doygunluk yoğunluklarından kaçınarak net floresan sinyalleri için pozlama süresini ayarlayın. Tüm örnekler için aynı ayarı kullanmayı deneyin.
15. Vahşi tip filamentler de floresan göstereceğinden, bu arka plan floresansı için yukarıdakiyle aynı ayarlara sahip görüntüler yakalayın.NOT: GFP'yi ifade eden suş daha yüksek bir sinyale sahip olmalıdır; aksi takdirde GFP'yi ifade etmez.
16. Pozlama sürelerine ve floresan görüntülerin piksel yoğunluklarına bağlı olarak, farklı filamentlerin GFP içeriğini hesaplayın ve karşılaştırın.

Sonuçlar

Şekil 1. Phormidium lacuna filamentleri dönüşümden 5 hafta sonra. sfGFP ekspresyon vektörü pMH1 kullanıldı; seçim 120 μg/mL kanamisin ile f/2 ortamında gerçekleşti. Yeşilimsi filamentle...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bacto Agar	OttoNorwald	214010
Floresan mikroskobu ApoTome	Zeiss
Floresan mikroskobu Axio Imager 2	Zeiss
Kanamisin	Sigma-Aldrich	25389-94-0
Mikroskop DM750	Zeiss
Midi hazırlık plazmit ekstraksiyon kiti NucleoBond Xtra Midi kiti	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
Işık kaynağı, floresan tüp L18W/954 gün ışığı	OSRAM		Siyanobakterilerin yetiştirilmesi
Işık kaynağı, LED panel XL 6500K 140 W	Çiçek Yıldızı	YOK	Siyanobakterilerin yetiştirilmesi
Petri kapları polistiren, 100 mm x 20 mm	Merck	P5606-400EA Serisi
Petri kapları polistiren, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA Serisi
Pipetman 100-1.000 μL	Gilson'ın	Ürün numarası: FA10006M
Pipetman 10-100 μL	Gilson'ın	Ürün numarası: FA10004M
Plastik pipetler 10 mL, steril	Greiner	607107
Çalkalayıcı Unimax 2010	Heidolph Enstrümanları		Yetiştirme için
Plastik tüp, steril, 50 mL	Greiner	227261
Ultraturrax Sessiz Kırıcı M	Heidolph Enstrümanları		Homojenizatör
F/2+ sıvı ortam	f/2-orta, 10 kat artırılmış NaNO₃ ve NaH₂PO₄ (0,88 mM NaNO₃, 36 μM NaH₂PO₄
F/2+-agar	%3 (a/h) bakto agar, yapay deniz suyu, %0,1 (h/h) eser element çözeltisi, %0,05 (h/h) vitamin çözeltisi, 8,8 mM NaNO₃, 0,36 mM NaH₂PO₄