Homolog Rekombinasyon Yoluyla Siyanobakterilerde Antibiyotik İşaretli Mutantların Üretilmesi

Özet

Kaynak: Lea-Smith, D.J., ve diğerleri. Model Siyanobakteriyel Türlerde İşaretli ve İşaretsiz Mutantların Üretimi. J. Vis. Uzm. (2016)

Video, siyanobakterilerde antibiyotik işaretli mutantlar üretmek için bir yöntem göstermektedir. Protokol, siyanobakterilerin kültürlenmesiyle başlar, ardından yüzey pililerini koruyan santrifüjleme ve yıkama adımları gelir. Daha sonra homolog dizilerle çevrili bir antibiyotik direnç geni taşıyan bir plazmit eklenir. İnkübasyon sırasında, plazmit pili yoluyla içselleştirilir ve homolog rekombinasyon yoluyla hedef genin yerini alır. Mutant suşu izole etmek ve saflaştırmak için antibiyotik seçimi ve yeniden çizgi kullanımı kullanılır.

Protokol

1. Kültür Besiyerlerinin Hazırlanması
   1. Castenholz'a (1988) göre Mavi-Yeşil ortam 11'i (BG11 ortamı) hazırlayın.
      1. 100x BG11, eser elementler ve demir stoğundan oluşan stok çözeltileri hazırlayın (Tablo 1).
      2. Fosfat stoğu, Sodyum karbonat (Na₂CO₃) stoğu, N-[Tris(hidroksimetil)metil]-2-aminoetansülfonik asit (TES) tamponu ve Sodyum bikarbonat (NaHCO₃) için ayrı çözeltiler hazırlayın (Tablo 1).
      3. Fosfat ve Na₂CO₃ stoklarını otoklavlayın. TES tamponunu ve NaHCO₃'yu 0,2 μm filtrelerle filtreyle sterilize edin.
      4. 976 ml su, 10 ml 100x BG11, 1 ml eser element ....

Sonuçlar

Şekil 1: İşaretli ve işaretsiz nakavtların üretimi için plazmit yapısı, örneğin, cpcC1 ve cpcC2 Synechocystis'te

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NaNO₃	Sigma	S5506 Serisi
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016 Serisi
Sitrik asit	Sigma	C0759 (İngilizce)
Na₂EDTA	Balıkçı	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634 Serisi
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750 Serisi
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Ortak(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
Ferrik amonyum sitrat	Sigma	F5879 Serisi
K₂HPO₄	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Balıkçı	SODC001
TES	Sigma	T1375 Serisi
NaHCO₃	Balıkçı	SODH001
HEPES	Sigma	H3375 Serisi
Siyanokobalamin	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Sakaroz	Balıkçı	SUC001
Petri kabı 90 mm üç bacalı	Greiner	633185
0,2 μm filtreler	Sartorius	16534
100 ml'lik konik şişeler	Borcam	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
Phusion yüksek kaliteli DNA polimeraz	Phusion	F-530 Serisi
Agaroz	Melford Belediyesi	MB1200 Serisi
DNA saflaştırma kiti	MoBio	12100-300
Kısıtlama endonükleazları	NEB
T4 ligaz	Termo Bilimsel	EL0011
Luria Bertani suyu	Davetli	12795-027
MES	Sigma	M8250 Serisi
Kanamisin sülfat	Sigma	60615
Ampisilin	Sigma	A9518 Serisi
GeneJET plazmit mini hazırlık kiti	Termo Bilimsel	K0503 Serisi
14 ml yuvarlak tabanlı tüp	BD şahini	352059
Gliserol	Sigma	G5516 Serisi
DMSO'nun	Sigma	D8418 Serisi