Manyetitle gömülü bakteriyel nanoselüloz pelliküllerinin üretimi

Özet

Kaynak: Arias, S. L. ve diğerleri. Demir Oksit Nanopartikülleriyle Fonksiyonel Manyetik Bakteriyel Nanoselülozun Üretimi. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, Gluconacetobacter xylinus tarafından üretilen bakteriyel nanoselüloz pellikülünde manyetit nanopartiküllerinin yerinde sentezini göstermektedir. Manyetik bakteriyel nanoselülozun demir iyonu infüzyonu, alkali çökeltme ve arıtma yoluyla nasıl üretildiğini açıklar.

Protokol

1. Polimer kaplı demir oksit nanopartiküllerinin sentezi ve bakteriyel nanoselüloz (BNC) zarında biriktirilmesi

1. 1.000 ml yüksek saflıkta suyu azot gazıyla kabararak sudaki çözünmüş oksijeni giderip yerine azotla değiştirin.
2. Üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişe, demir (III) klorür heksahidrat (FeCl₃·6H₂O) ve demir (II) klorür tetrahidrat (FeCl₂·4H₂O) oranında bir çözelti hazırlamak için 2:1 molar oranında bir çözelti hazırlayın; bu çözelti oksijensizleştirilmiş yüksek saflıkta su ile seyreltilmiştir. Örneğin, 10 ml oksijensizleştirilmiş yüksek saflıkta 5,4 g FeCl₃·6H_2Ove 1,98 g FeCl₂·4H_2Okullanın. Bu hazırlık çok viskoz ve karıştırılması zor hale gelirse, 20 ml oksijensizleştirilmiş yüksek saflıkta 0,54 g FeCl₃·6H_2Ove 0,198 g FeCl₂·4H_2Okullanın.
   NOT: FeCl₂·4H 2O'nun havaya maruz kalma süresini bukimyasal bileşiği mümkün olan en hızlı şekilde tartarak azaltın. Üç boyunlu yuvarlak taban şişesine yerleştirildikten sonra, üç boyunlu yuvarlak taban şişesini septum stopperleriyle kapatın, ta ki azot gazı kaynağı ve kondansatör borusuna bağlanana kadar.
3. Azot gazı beslemesini, septum stopper'a deliklenmiş ve kabın boynuna sabitlenmiş bir iğneye bağlayarak, damarın iki boynunu kullanarak sürekli azot gazı girişi ve çıkışı sağlar.
4. Reaktantların bulunduğu kaba 1 BNC pellicle (çapı 15,6 mm ve kalınlığı 2-3 mm) yerleştirin. Numunenin tamamen sıvının içinde olduğundan emin olun.
5. Damarın kalan boynunu bir yoğunlaştırıcı tüpüne bağlayın. Ayrıca, kondenser tüpünün üzerine susuz kalsiyum sülfat içeren bir kurutma tüpü kullanın. Suyu kondansatör borusundan geçirin.
6. Tüm cam eklemleri vakum yağıyla mühürleyin.
7. Çözeltiyi silikon yağ banyosu, karıştırıcı bir sıcak plaka ile 80 °C'ye kadar ısıtın ve bu sıcaklığı 1.10. adıma kadar tutun. Reaktanları 350 rpm'de 5 dakika boyunca küçük bir manyetik karıştırma çubuğu kullanın. BNC'nin demir çözeltisiyle uygun şekilde emdirildiğinden ve reaktantların tamamen çözündüğünden emin olun. Deneyin sonuna kadar karışımı karıştırmaya devam edin.
   NOT: Silikon yağının sıcaklığını doğrulamak için bir termometre kullanın. 80 °C'ye kadar stabil olmalı.
8. Karıştırma hızını 700 rpm'ye çıkarın ve 5 dakika içinde (düşürerek) 10 ml demir çözeltisine, septum stopper'da delilmiş pipetleme iğnesi ile 5 ml amonyum hidroksit (_{NH 4}OH, %14) ekleyin. Amonyum hidroksit eklendikten sonra, çözeltinin rengi sarı/turuncudan siyah'ya değişir.
9. Çözeltiyi 80 °C'de 5 dakika daha karıştırmaya devam edin. Numunenin bütünlüğünü korumak için yüksek hızlı karıştırmalardan kaçının. Yüksek hızlar, yani 1.000 rpm'nin üzerinde olduğunda, numuneyi yok edebilir.
10. Karışım sıcak plakasının alt kısmını kullanarak çözeltinin sıcaklığını 30 °C'ye düşürün ve 5 dakika daha karıştırmaya devam edin. Sonra sıcak plakayı kapatın. Bu noktada, demir oksit nanopartikülleri (IONP) BNC ağına entegre edilmiştir.
11. Karışımı oda sıcaklığına (RT) kadar soğutun ve manyetik nanopartiküller (MNP) ile BNC'yi güçlü bir kalıcı mıknatıs (örneğin, 1 Tesla) ile ayırın. Bunu yapmak için, karışımı bir kap şişesine aktarın ve ardından mıknatısı kaba yakın tutarken, süpernatantı boşaltırken MNP'leri ve BNC'yi yerinde tutun.
    Not: Güçlü mıknatıslarla işlerken dikkatli olun, yanlış kullanıldığında zararlı olabilirler. (1.12) - (1.14) ve (1.16) adımlarında, partiküllerin oksidlenmesini önlemek için daha önce (1.1)'de hazırlanan oksijensiz, yüksek saflıklı su kullanılır.
12. MNP'leri ve BNC'yi 100 ml suya yeniden süsleme. BNC'ye güçlü şekilde dahil edilmeyen tüm MNP'leri çıkarmak için çözeltiyi hafifçe sallayın. Mıknatıs kullanarak MNP'leri ve BNC'yi yerinde tutarak süpernatantı tekrar dedikt edin.
13. MNP'leri ve BNC'yi suyla birkaç kez yıkayarak süpernatan nötr pH (pH~7) ulaşana kadar, kolorimetrik şerit kullanılarak ölçülür.
14. Manyetik fonksiyonel BNC veya manyetik bakteriyel nanoselülozu (MBNC) cımbız kullanarak MNP'lerden ayırın ve MBNC'yi birkaç kez suyla durulayın, ta ki su berrak daşınana kadar.
15. MBNC'yi UV (110-280 nm) UV'ye maruz bırakarak sterilize edin.
16. 500 ml oksijensiz, yüksek saflıkta suyu 120 °C'de 20 dakika boyunca otoklav edin ve MBNC'yi bu sudan 20 ml içinde saklayın.
17. Aseptik olarak, örneği %1 polietilen glikole (PEG) batırın ve RT (37 °C) sıcaklığında 2 saat karıştırın. Bu prosedür, özellikle yüzeyde maruz kalan BNC'de biriktirilen demir oksit nanopartiküllerinin biyouyumluluk ve stabilitesini artırır. PEG kaplaması MBNC 3D ağı üzerinden dağıtılacak.
    NOT: Çıplak IONP'ler, yüksek kimyasal aktiviteleri nedeniyle havada kolayca oksitlenir. PEG biyoparçalanmayan bir madde olarak kabul edilse de, kimyasal kararlılığı su içeriği, pH, sıcaklık, enzim varlığı, reaktif oksijen türleri, reaktif azot türleri gibi uygulanan biyolojik koşullara bağlıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Demir(III) klorür heksahidrat	Sigma Aldrich	236489-100G
Amonyum Hidroksit	Macron İnce Kimyasalları	6665-46
Poli(etilen glikol), ortalama Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Demir (II) klorür tetrahidrat	Sigma Aldrich	44939-250G
Ansusuz Kalsiyum Sülfat	W.A. Hammond Drierite	13001
Yüksek vakum yağ	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
pH test şeritleri	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Yuvarlak tabanlı üç boyun açılı damıtma matarası	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Yağ banyoları için silikon yağı	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Kurutma Tüpü	Chemglass	CG-1295-01
Septum Stopper, Kılıf Tipi	Chemglass	CG-3022-98
Manyetik karıştırma çubuğu	Chemglass	CG-2001-05
Kondansatör	Chemglass	CG-1218-01
Sıcaklık Kontrolörü	BriskHeat	SDC120JC-A
Karıştıran Sıcak Plaka	Fisher Scientific	11-100-49SH