Mikrop-Solucan Etkileşimlerini İncelemek İçin Yüksek Verimli Floresan Tahlil

Özet

Kaynak: Ali, I. ve diğerleri. Caenorhabditis elegans sağlığına etkisi olan mikrobiyal izolatların yüksek verimli taraması. J. Vis. Exp. (2022)

Bu video, Caenorhabditis elegans'ta bağırsak bakterilerinin stres direncini nasıl etkilediğini değerlendirmek için yüksek verimli bir floresan testi göstermektedir. Patlamış bağırsak granüllerinden mavi floresansı takip ederek, test bakterilerine maruz kalan solucanlarda daha erken ölüm sinyallerini ortaya çıkarıyor.

Protokol

1. Etiketsiz Caenorhabditis elegans (C. elegans) hayatta kalma puanlama (LFASS), ısı şoku ve oksidatif test kurulumu (13 - 14. Günler)

1. Solucanların gelişim evresini değerlendirin. Solucanların %>90'ı L4'e ulaştığında, solucanları 15 mL konik tüplerde 10 mL'ye kadar steril M9 çözeltisinde toplayın.
2. Solucanları 142xg ile 2 dakika boyunca 4 °C'de döndürerek, üst yüzeyi çıkararak ve her yıkama arasında 10 mL taze steril M9 ekleyerek en az 4 kez yıkayarak Escherichia coli OP50 bakterilerinden kurtulun. Solucan pelletini 10 mL M9'a yeniden süzül.
3. 50 μL solucan çözeltisi, 950 μL M9 içeren düşük yüzeyli bir bağlama tüpüne aktarılır. Tüp içeriğini nazikçe karıştırdıktan sonra, solucan tortulmasını önlemek için ıslak düşük bağlı bir pipet ucu kullanarak hızlıca 3-4 ayrı 10 μL damlayı cam slayt veya nematod büyüme ortamı (NGM) plakasına aktarın. Solucan sayılarını stereomikroskop altında 16x büyütmede sayın. 3-4 damladan sayıları ortalayın ve solucan çözeltisindeki mikrolitre başına solucan sayısını belirleyin.
4. 10 mL'lik tüpteki solucan konsantrasyonunu 8 μL'de ~120 solucana ulaşacak şekilde ayarlayın. Çözüm Adım 1.2'de hazırlanıyorsa. yeterince yoğunlaşmamışsa, solucanları aşağı döndürüp M9'u buna göre çıkararak 8 μL'de 120 solucan elde edersiniz.
5. Daha önce hazırlanmış sekiz 96 kuyruklu NGM-agaroz plakasının her bir kuyusuna, çok kanallı pipet veya tekrar pipeti kullanılarak 8 μL solucan çözeltisi (~120 solucan) aktarın. Solucan kaybını sınırlamak için düşük tutma uçları kullandığınızdan emin olun. Ayrıca, büyük yetişkin solucanların mekanik stresi sınırlaması için uç uçlarının kesilmesi de gerekebilir.
   NOT: Testin güvenilir çalışması için en az 30 canlı sağlıklı solucan gerekir, ancak en iyi şekilde her kuyu başına yaklaşık 100 solucan olur.
6. Solucan ve bakteri tohumlu 96 kuyu NGM-agaroz plakalarını 25 °C'de 36 saat boyunca kuluçka yapın.
7. Plakaları 12-24 saat arasında kontrol edin, solucanların tam dolu olduğundan emin olun. Yeniden besleme gerekirse, bakterileri 15 °C'de depolanan 96 kuyu bakan bakteriyel dizide tekrar askıya alın ve solucanların 36 saatlik kuluçka dönemi bitmeden açlık risk altında olduğu 96 kuyruklu NGM-agaroz plakalarına 10 μL bakteriyel çözeltiyi ekleyin (aç solucanlar çok farklı sonuçlar verir, Bu yüzden bu çok önemli).
   NOT: Aşağıdaki adımların 15. günde yapılması gerekmektedir. Teste başlamadan önce, okuma yüksekliğinin optimize edilmesi gerekebilir. Optimal okuma, kuyunun dibinin 20-50 μm üzerinde sağlanacaktır. Bu, plaka okuyucunun modeline bağlı olacak. Bazıları Z-tarama imkanı sunarken, diğerleri manuel yükseklik girişine izin veriyor. Optimal yüksekliği en yüksek mavi floresans sinyalinin (365 nm/430 nm) tespit edildiği seviyeye ayarlayın. Bazı plaka okuyucular, yapışkan hücre testleri için optimize edilmiş sabit bir yükseklikte çalışabilir ve LFASS testleri için ideal olmayabilir.
8. 36 saat sonra, 96 kuyu plakasının her kuyusuna 30 μL M9 dağıtın.
   NOT: Termal gerilim testleri için, plaka okuyucunun testi yapmak için gereken sıcaklığa ulaşmış olması gerekir ve önceden açılması gerekebilir. Mevcut protokol, öldürme hızını maksimize etmek için 42 °C kullanır, ancak bu yaklaşım 30 °C'nin üzerindeki diğer sıcaklıklar için de geçerlidir.
9. Solucanları (yaklaşık 20 μL) sabit düzenlere göre 384 kuyu plakaya aktarın, düşük tutucu uçlar kullanarak (büyük solucanların yetişkin solucanlar için mekanik stresi azaltmasına izin vermek için uçların ucunu kesmeyi düşünün).
   NOT: Mevcut çalışmada, burada tanımlanan iki test için iki farklı plaka okuyucu ayarı kullanılmıştır (termal stres ve oksidatif stres), bu nedenle bu iki test için hazırlanan örnekler aynı 384 kuyu levhada kaplama yapılmamalıdır.
10. Plaka okuyucuların doğru şekilde kurulduğundan emin olun (Tablo 1).
11. 384 kuyruklu plakaları daha fazla M9 ile doldurun, nihai hacmi 60 μL olarak kuyu başına hedefleyin. Termal stres testi için 40 μL M9 ekleyin, tert-bütil hidroperoksit (t-BHP) kaynaklı oksidatif stres için ise 6 μl t-BHP içinde 34 μL M9 ekleyin.
    1. T-BHP eklendikten sonra 2 dakika içinde teste başlayın (ideal olarak, tüm solucanlar aynı anda t-BHP'ye maruz kalmalıdır, test çözünürlüğü süresi 2 dakikadır). Mümkün değilse, testin başlanmasından önce t-BHP pipetlenmesinde harcanan süreyi tahmin etmek için zamanlayıcı kullanın; böylece ortalama ölüm süresinin daha sonra ayarlanmasına olanak tanır.
12. Plakaları şeffaf kapağıyla kapatın. 384 kuyruklu plakaların kenarlarını maskeleme bandı ile (plaka ve kapağın üzerine bantla) kapatın, böylece bant kapağın üzerinden veya plakanın altına geçmesin. Bantı, test sırasında buharlaşmayı en aza indirmek için bir neşter kullanarak bir neşter ile aralıklı olarak kesin.
13. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve çalıştırmaya başlayın. 6-12 saat boyunca her 2 dakikada bir 365 nm'de uyarı ve 435 nm'de emisyon tespit etmeyi hedefleyin (Tablo 1).
    NOT: Genellikle, 42 °C ısı stresi testleri için 6 saat, %7 t-BHP oksidatif stres testleri için ise 8 saat yeterlidir.

Tablo 1: Oksidatif ve ısı stresi testi ayarları. Bu çalışmada kullanılan floresans plaka okuyucularında oksidatif (A) ve ısı (B) stres testleri için kullanılan ayar örnekleri.

Malzemeler