Apoplastik bakterilerin şırınga bazlı basınç yöntemiyle ekstraksiyonu

Özet

Kaynak: Rufián, J. S. ve diğerleri, Bitki dokusunda Pseudomonas şıringae genlerinin İfadesinin Tek Hücreli Analizi. J. Vis. Exp. (2022)

Bu video, bitki hücreleri arasındaki hücrelerarası boşluk olan apoplast içinde çoğalan ve mikrokoloniler oluşturan apoplastik bakterilerin çıkarılması için şırınga tabanlı bir basınç yöntemini gösteriyor. Bu yöntem, aşağı akış tek hücre analizi için uygun olan kalıntısız bakteriyel örnekler elde eder.

Protokol

Apoplasttan bakteri çıkarımı

1. Aşılamadan dört gün sonra, Arabidopsis bitkisinin hava kısmını veya fasulye bitkisinin aşılanmış yaprağını kesin ve iğnesiz 20 mL'lik bir şırıngaya yerleştirin (Şekil 2G). Fasulye yaprakları için, yaprağı kendi üzerine yuvarlayın, abaksial yüzü dışa doğru bırakın, Şekil 2F'de gösterildiği gibi.
2. Dokunun üzerini kapatacak kadar damıtılmış su ekleyin (genellikle 10-15 mL).
3. Pistonu yerleştirin ve şırıngayı dikey pozisyonda tutarak, ucu yukarıya bakacak şekilde, şırınganın içindeki fazla hava ve hava kabarcıklarını namluya hafifçe vurarak tüm havayı ucun yakınında konumlandırın. Havayı çıkarmak için pistonu kaydırın. Şırtingin içinde mümkün olduğunca az hava kaldığında, şırınganın namlusunun ucunu parafin filmiyle kaplayın.
4. Pistonu dikkatlice basarak doku koyulaşana kadar pozitif basınç oluşturun (Şekil 1I ve Şekil 2H). Sonra, negatif basınç oluşturmak için pistonu çekin (Şekil 1J ve Şekil 2I). Bu adımı 3-5 kez tekrarlayın.
5. Parafin filmi ve pistonu çıkarın ve apoplast ekstraksiyonlu bakterileri içeren sıvıyı toplayın, Şekil 2J'de olduğu gibi.

Sonuçlar

Şekil 1: Arabidopsis bitkileri kullanılarak bakteriyel aşılama ve apoplast ekstraksiyonu . (A) Saksının düzgün şekilde takılmış metal file ile hazırlanması. (B) To...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
20 mL şırınga			Özel bir şart yok
50 mL konik borular	Sarstedt
Parafilm	Pechiney Plastik Ambalajı
Cımbız			Özel bir şart yok
Vakum odası çapı 25 cm	Kartell	554
Vakum pompası	GAST	DOA-P504-BN