Rekombinant Bakteriyel Proteinin Arındırılması için Afinite Kromatografi Tekniği

Özet

Kaynak: Becker, B. ve diğerleri. Mayada Risin Toksin A Zinciri (RTA) kaçakçılığı için gerekli hücresel bileşenleri belirlemek için basit bir floresans tabanlı raporlayıcı testi. J. Vis. Exp. (2017).

Bu video, polihistidin etiketli bir rekombinant proteinin nikel bazlı affinite kromatografisi kullanılarak arıtılmasını göstermektedir. Anahtar adımları belirtir; bunlar arasında sonikasyon yoluyla bakteriyel lizizi, lizatın aydınlaştırılması ve filtrasyonu ile imidazol kullanılarak hedef proteinin seçici bağlanması ve elüsyonu yer alır.

Protokol

1. His-etiketli RTA'nın Affinity Kromatografisi ile Arındırılması

1. Hücreleri buz üzerinde şu protokolle sonike edin: 15 saniye darbe (20 mikron), 30 saniye duraklama. Bu adımı beş kez tekrarlayın.
2. Santrifüj hücresi lizatı 21.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika boyunca ve steril şırınga filtre sistemi ile süpernatantı filtreleyin (0,2 μm gözenek boyutu).
   NOT: Başarılı şekilde soniklenmiş örneklerin hücre pelletleri şeffaf sınırlar gösterir.
3. Steril filtrelenmiş E. coli süpernatantından His-etiketli RTA fraksiyonunu arındırmak için 5 mL Ni²⁺ tabanlı affinite kolonuyla donatılmış otomatik bir arıtma sistemi kullanın . Genel olarak, 1 mL/dakika elüsyon hızı kullanın ve tüm arıtma sistemini soğutarak verimsiz toksin bağlanmasını ve toksin aktivitesinin kaybını önleyin.
   NOT: Verimli RTA arıtımı parametreleri Tablo 1'de listelenmiştir.
   1. Kısaca, affinite sütununu 20 mL bağlama tamponu ile dengeleyerek depolama tamponunu kaldırın. Steril filtrelenmiş süpernatantı bir şırınga ile affinity kolonuna uygulayın.
   2. Kolonu 25-35 mL bağlanma tamponu ile yıkayarak kolondan ayrılmış proteinleri çıkarın. Yıkama adımını, 280 nm'deki UV absorbansı başlangıçtaki UV değerine yaklaşana kadar yapın.
   3. 20-35 mL elution tamponu içinde elyut bağlı RTA fraksiyonu (500 mM imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7.2) ve örneği buz üzerinde tutun (Şekil 1A ve Şekil 1B).
      NOT: RTA fraksiyonunun elülasyonu, UV emiliminde artışla işaretlenir. Lütfen spesifik olmayan bağlı proteinlerle kontaminasyonu önlemek için bu fraksiyonu yalnızca toplamayı unutmayın.

Tablo 1: Sütun tabanlı affinite arındırma ve tuzdan arındırma için kullanılan parametreler. Tüm ilgili sütun ayarlarının listesi (örneğin, akış hızı, elusiyon tampon konsantrasyonu, dengeleme ve yıkama adım süresi) ve ölçülen parametrelerin (örneğin, iletkenlik veya UV emilim).

Afinite kromatografi parametresi
Ölçüm parametreleri	UV (280 nm), Elusyon tampon konsantrasyonu, İletkenlik
Ayarlar	Değişken/Birim	Değer
Akış hızı	mL/dakika	1
Maksimum kolon basıncı	Mpa	0.35
Dalga boyu	Nm	280 nm
Bağlama tamponu	Pompa pozisyonu	A
Elution tamponu	Pompa pozisyonu	B
Başlangıç konsantrasyon elusyonunun tamponu	%	0
Sistem hacim tazminatı	Ml	10
Sütun dengesi	Ml	20
Süperloop/şırınge üzerinden örnek enjeksiyonu	Ml	hücre lizatat hacmi
Yıkama adımı	Ml	20-35
Elution adım	Ml	20-35
Elülasyon sırasında konsantrasyon elusyonunun tamponu	%	100
%20 EtOH ile kolonun yeniden kalibrasyonu	Ml	50
Tuzdan arındırma parametresi
Ölçüm parametreleri	UV (280 nm), İletkenlik
Ayarlar	Değişken/Birim	Değer
Akış hızı	mL/dakika	4
Maksimum kolon basıncı	Mpa	0.35
Dalga boyu	Nm	280 nm
Bağlama tamponu	Pompa pozisyonu	A
Elution tamponu	Pompa pozisyonu	B
Başlangıç konsantrasyon elusyonunun tamponu	%	0
Sistem hacim tazminatı	Ml	10
Sütun dengesi	Ml	20
Süperloop/şırınge üzerinden örnek enjeksiyonu	Ml	hücre lizatat hacmi
Tuz atlatma tampon enjeksiyonu (0,8 M sorbitol)	Ml	100
%20 EtOH ile kolonun yeniden kalibrasyonu	Ml	50

Sonuçlar

Şekil 1: PET-RTA_(His)6 veya boş vektör kontrolü içeren E. coli hücrelerinin temsil affinite kromatografisi ve tuzsuzlaştırma sonuçları.(A) Vektör pET24-RTA_{(His)6'dan RTA...}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Spektrofotometre Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		Eski model, diğer modeller mevcut
Fluoroskan Yükselişi	Termo Bilimsel	5210470	eski model, artık mevcut değil
ÄKTAPurifier	Termo Bilimsel	28406266	Ürün üretimi durduruldu ve yerine yenisi alındı
HisTRAP HP kolonu	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP tuz temizleme kolonu	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart steril filtre	Sartorius	16534K	0,2 μm gözenek boyutu
BCA protein test kiti	Delmek	23225
660 nm test kiti	Termo Bilimsel	22660
96 kuyulu plaka	Termo Bilimsel	260860