$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bakteriyel Nanoselülozun (BNC) Hazırlanması
Not: Tüm adımlar, aksi belirtilmedikçe aseptik koşullarda yapılır.
- Kültür ortamı hazırlayın.
- 25 g maya özdüsü, 15 g pepton, 125,0 g mannitol ve 500 ml yüksek saflıkta su birleştirerek 500 ml sıvı kültür ortamı hazırlayın. Bu karışımı 120 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın ve 4 °C'de saklayın.
- 100 ml yarı katı ortam hazırlayın; 15 g agar, 5,0 g maya özdüsü, 3,0 g pepton, 25,0 g mannitol ve 100 ml yüksek saflıkta su ekleyin. Bu karışımı 120 °C'de 20 dakika boyunca otoklavla geçirin. Otoklavlandıktan sonra, 5 ml karışımı 90 mm x 16 mm boyutlarında plastik Petri kabına bırakın. Çözeltiyi 4 °C'de jelleşmesine izin verin ve bu sıcaklıkta daha fazla kullanana kadar saklayın.
- Glucoacetobacter xylinus (G. xylinus) suşu, üreticinin talimatlarına göre 1 ml sıvı kültür ortamı eklenerek ve pipetlerle dondurulmuş şişelerde saklanarak yeniden hidratlayın.
- Yarı katı ortam içeren Petri kaplarını, küçük bakteriyel süspansiyon damlalarıyla aşılama döngüsü ile aşılayın. Aşı, halkayı kenardan tabakın ortasına zigzak şeklinde hareket ettirerek tüm Petri kabını kapladığından emin olun.
- Petri kaplarını CO2 olmadan 72 saat boyunca 26 °C'de kuluçka için. Kuluçka dönemi tamamlandıktan sonra küçük beyaz koloniler görünür olur. Koloniler hemen kullanılmazsa, Petri kaplarını 4 °C'de saklayarak kapağı Parafilm ile kapatıp kapları ters konumlandırın. Koloniler bu şekilde 6 aya kadar saklanabilir.
- 24 kuyruklu doku kültür plakasının her kuyusuna 2 ml sıvı kültür ortamı aktarın. Aşılanmış Petri kaplarından aşılanan iğneyle iki koloni alın ve doku kültür plakasının ilk kuyusuna yerleştirin. Kalan 23 kuyu için aynı işlemi tekrarlayın.
- Doku kültür plakasını 30 °C'de 7 gün boyunca kuluçka edin. Bu, Şekil 1'de gösterildiği gibi toplam 16 mm çapında ve yaklaşık 2-3 mm çapında 24 BNC pellikülü elde edecektir. Not: Kuluçka dönemi boyunca, örneğin plakaları sallayarak bakteri kültürünü rahatsız etmeyin. Kuluçka döneminde, G. xylinus , glukopiranoz şeker moleküllerini ekstrüziye ederek hava-sıvı aralığında polimerik kristal bir ağ oluşturur; bu ağ, statik yetiştirme koşullarında şişenin şeklini ve boyutunu benimser. Bu polimerik matris, bakteriyel nanoselüloz (BNC) olarak bilinir ve kuluçka döneminin sonunda belirgindir.
- BNC pelliküllerini büyüme ortamından toplayıp 200 ml %1 NaOH çözeltisiyle 50 °C'de 1 saat boyunca sterilize edin; böylece tüm G. xylinus izleri giderilecektir. Isteğe bağlı olarak, bu çözeltiyi manyetik bir çubuk ve karıştırma plakası kullanarak 300 rpm'de karıştırabilirsiniz. NaOH çözeltisini atın ve 200 ml taze hazırlanmış %1 NaOH çözeltisi ekleyin. Aynı işlemi bir kez daha tekrarlayın veya çözelti içindeki BNC pellikülleri saydam bir görünüm kazanana kadar.
- BNC pellicle'larını üç kez suyla durulayın ve RT'de yüksek saflıkta suyla saklayın. BNC pellicle'lerinin tamamen suya battığından ve hiçbir zaman kurumasına izin verilmediğinden emin olun.
- BNC pellicle'larını 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklav edin. Not: Märtson ve iş arkadaşları tarafından yapılan in vivo deri altı çalışması, implantasyonun 60 haftasından sonra BNC'nin bozulma belirtisi göstermediğini gösterdi. Gerçekten de, BNC doğada mikrobiyal ve mantar enzimleri tarafından parçalanabilir ve memelilerde bulunmamaktadır. Öte yandan, BNC'nin biyoparçalanabilirliği, mikrofibril ağı in vivo zayıflatan mekanik, kimyasal ve biyolojik süreçlerin sonucu olabilir.
