$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kimyasallar ve Ekipmanların Hazırlanması
1. %1 sodyum heksametafosfat (SHMP) (NaPO3)n çözeltisi 500 ml hazırlayın ve otoklavlama ile sterilize edin.
2. Nitroselüloz (NC) filtrelerini (gözenek boyutu 0,22 μm, çapı 47 mm) kapalı cam Petri kaplarında otoklavlayarak sterilize edin.
3. NC filtreleri (gözenek boyutu 0,22 μm, çapı 25 mm) kapalı cam Petri kaplarında otoklavlayarak sterilize edin.
4. Steril 50 ml'lik tüplerin (kapağı takılı) boş ağırlığını tartın ve not edin (her örnek için bir tüp).
5. Tris-EDTA-buffer (TE-buffer) 1x hazırlayın: 10 mM Tris (tris(hidroksimetil)aminometan) ve 1 mM EDTA tamponundan oluşan bir çözelti oluşturun. pH değerini 8'e ayarlayın ve otoklavlama ile sterilize edin.
6. 0,02 g lizozimi 1 ml TE-tamponunda çözerek lizozim çözeltisi (20 mg/ml) hazırlanır. İdeal olarak, her seferinde taze olsun. 4 °C'de en fazla 1 hafta saklamayacağım.
7. 8 g/L sodyum klorürü (NaCl) damıtılmış suda çözerek fizyolojik bir çözelti hazırlayın. Otoklavlama ile sterilize edin.
2. Biyokütlenin Tortuldan Ayrılması
1. Etanol alevli metal kepçelerle önceden tartılmış steril 50 ml'lik tüplere 3 g tortu örneği ekleyin. Bunu, kontaminasyondan kaçınmak için temiz, UV sterilizasyonlu bir biyogüvenlik dolabında yapın.
2. Numuneye 15 ml %1 steril (otoklavlanmış) SHMP çözeltisi ekleyin; steril dereceli buret kullanarak. SHMP çözeltisi de kirlenmeyi önlemek için filtrelenebilir.
3. Tortu ve SHMP çözeltisini sıvı dağıtıcı/homojenizer (örneğin, Ultra-Turrax homojenizer) ile homojenleştirin. Kullanımdan önce dispersion rotorunu %70 etanol sterilize edebilir veya otoklav yapar. Homojenizasyonu 1 dakika boyunca 17.500 rpm'de çalıştırın. Numuneyi 2 dakika dinlendirin ve aynı rotor hızında 1 dakika boyunca homojenizasyonu tekrarlayın.
4. Numuneyi 10 dakika bekletin. Bu adımda en ağır parçacıklar (mineraller) çöker. Ancak hücreler ve örnekteki organik bileşenler çözelti halinde kalır. Daha sonra, hücre biyokütlesi içeren süpernatant çözeltiyi temiz bir 50 ml'lik tüpe aktarın, tortu pelletini rahatsız etmemeye özen gösterin.
5. Tortu pelletine, steril dereceli buret kullanarak %15 steril (otoklavlanmış) SHMP çözeltisi tekrar ekleyin. Sonra 2.3 ve 2.4 numaralı adımları tekrarlayın. Bu tekrar, tortunun mineral bileşeninden maksimum miktarda hücre ve organik parçacıkların ayrılmasını sağlar. Bu ikinci ayrımın süpernatantı, birinci ayrımdaki süpernatantla birleştirilebilir.
Not: Aşağıdaki adımların tamamı süpernatant (hücre biyokütlesi içeren) üzerinde yapılır. Mineral bileşeni (tortu pelleti) atılabilir.
6. Örneği 20 x g ile 1 dakika boyunca santrifüjlendirin. Bu adım, biyolojik hücre materyali hâlâ çözeltide kalırken küçük mineral parçacıklarının yerleşmesi için g-kuvvetini yeterince artırır. Santrifüjlemeden sonra, hücre biyokütlesi içeren süpernatant çözeltiyi temiz bir 50 ml'lik tüpe aktarın. Mineral peletini atın.
7. Biyokütle içeren çözeltinin nihai hacmini numuneyi tartarak belirleyin. Ağırlık belirleme, numuneyi dereceli bir silindire aktarmak zorunda kalmadan kaçınır ve kontaminasyon riskini azaltır.
3. Filtre Membranında Biyokütle Toplama
1. 47 mm çapında membranlar için bir filtrasyon ünitesi ve vakum pompası hazırlayın. Filtrasyon ünitesini ya otoklavla sterilize edin ya da (Pyrex cam ise) %70 etanol püskürterek ve Bunsen brületiyle ateşleyin. Protokole devam etmeden önce soğumasına izin verin.
2. Filtreleme ünitesine etanol alevli sterilize edilmiş forseps kullanarak steril bir NC membranı ekleyin.
3. Üst düzey numunenin yarısını ( 2.6. adımdan ibaren) membran filtrasyon ünitesine ekleyin ve vakum pompası ile membrandaki hücreleri toplayın.
4. Sıvı filtreden tamamen geçtiğinde, vakum pompasını durdurun ve etanol-alev sterilizasyonlu forseps kullanarak membranı dikkatlice çıkarın. Zarı steril bir Petri kabına yerleştirin.
1. Etanol alevli sterilize makasla zarı ikiye kesin. Zarın her iki yarısını ayrı bir 2 ml'lik tüpe ekleyin. Zarın yarısı tüm bakteri topluluğunun DNA çıkarımı ve analizi için kullanılacaktır. Filtrenin diğer yarısı -80 °C'de saklanır ve yedek olarak kullanılır.
5. Filtrasyon ünitesine yeni bir NC membranı yerleştirin ve örnek hacminin ikinci yarısından ( 2.6. adımdan) vakum pompası kullanarak biyokütle toplayın.
6. Sıvı filtreden tamamen geçtiğinde, vakum pompasını durdurun ve etanol alevli, sterilize edilmiş forseps kullanarak zarı dikkatlice çıkarın. Tüm zarı ayrı bir 2 ml'lik tüpe yerleştirin. Bu örnek, endosporların vejetatif hücrelerden ayrılması için tedavi için kullanılacaktır. Numune kullanılana kadar -20 °C sıcaklıkta saklanabilir.
4. Vejetatif Hücrelerin Lizisi
1. Endosporları vejetatif hücrelerden ayırmak için daha önce NC membranında toplanan biyokütle üzerinde işlem yapmak (adım 3.6).
1. Zar donmuşsa, 10 dakika boyunca RT rejiminde bırakın ve çözülmesini sağlar. Sonra, zarı steril bir Petri kabına yerleştirin ve etanol alavlı steril makasla yaklaşık 4 kez daha küçük parçalara kesin. Sonra, tüm membran filtre parçalarını steril 2 ml'lik bir tüpe yerleştirin.
2. Örnek zarını içeren tüpe 900 μl 1x TE (Tris-EDTA) tamponu (bkz. 1.5) ekleyin ve girdabla iyice karıştırın. Bu aşamada, biyokütle membrandan TE-tampon çözeltisine çıkarılır.
3. Tüpü 65 °C'de bir kuluçka makinesine 10 dakika ve 80 rpm boyunca yerleştirin. Sonrasında tüpü kuluçka makinesinden çıkarın ve 15 dakika soğumasına izin verin.
4. Son konsantrasyon olarak 2 mg/ml elde etmek için 100 μl taze hazırlanmış lizozim ( bkz. 1.5) ekleyin. Numune soğumadan önce lizozimi eklemeyin, çünkü bu enzimi bozabilir.
5. Örneği 37 °C'de 60 dakika ve 80 rpm boyunca kuluçka edin; bu, lizozimin vejetatif hücreleri lizelemesi için en uygun koşullardır.
6. Liz tamamlandıktan sonra, numuneye 250 μl 3 N sodyum hidroksit (NaOH) ve 250 μl %6 sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi eklenin. Bunu ekleyerek örnek hacmi 1,5 ml'ye ulaşır ve nihai konsantrasyon 0,5 N NaOH, nihai konsantrasyon ise %1 SDS olur.
7. Bu karışımı RT'de 60 dakika ve 80 rpm boyunca inkübe edin. Temel ve deterjan eklemek, nihai hücre lizisinde yardımcı olur. Bu deterjanların konsantrasyonu, vejetatif hücreleri lizleştirirken endosporlara zarar vermeyecek şekilde optimize edilmiştir.
8. 25 mm çapında membranları tutan steril bir filtrasyon ünitesi hazırlamak için otoklavlama yapın veya (Pyrex cam ise) %70 etanol püskürtülerek ve Bunsen brülörüyle ateşlendirin. Soğumasına izin ver.
9. Filtreleme ünitesine etanol-alev sterilize edilmiş forseps kullanarak 0,2 μm NC membranı (25 mm çapı) yerleştirin.
10. Aşama 4.7'deki örneği membrana ekleyin ve sıvıyı vakum pompası ile filtreleyin. Sıvı geçtiğinde, vakum pompasını kapatın. Bu aşamada, lizlenmiş vejetatif hücre materyali zarda tutulmadığı için çıkarılır. Sadece endosporlar membranda kalır.
11. Kalan deterjanları yıkamak için 2 ml steril fizyolojik çözelti ekleyin ve vakum pompasıyla sıvıyı filtreleyin.
12. Sıvı tamamen filtrelendiğinde, vakum pompasını kapatın. Membranı filtrasyon ünitesinde bırakın.