Escherichia coli'de floresan etiketli repressör protein aracılı replikasyon blokajı

Özet

Kaynak: Mettrick, K. A., Lawrence ve diğerleri, Floresan Repressör Operatör Sistemi Kullanarak E. coli'de Site-Specific Replikasyon Tıkanıklığının İndüksiyonu. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, kromozom tetO dizilerine bağlanan sarı floresan protein etiketli TetR'nin arabinoz kaynaklı ekspresyonu kullanarak Escherichia coli'de siteye özgü replikasyon çatal tıkanıklığını göstermektedir.

Protokol

1. Flüoresans Repressör Operatör Sistemi (FROS) ile Replikasyonun Bloklanması

1. Çoğaltma Blokajını Tetiklemek
   1. Seçim için gerekli şekilde antibiyotiklerle tenO dizisi ve pKM118 taşıyan bir E. coli suşunun gece boyunca taze kültürünü OD₆₀₀nm = 0.01 ile seyreltmek için sulandırılmış karmaşık ortamda (%0.1 tripton, %0.05 maya ekstraktı, %0.1 NaCl, 0.17 M KH_{2PO 4}, 0.72 M K_{2HPO 4}) ile seyreltin.
      NOT: Seçim için tetrasiklin eklemeyin çünkü bu sistemle uyumlu değildir. Kültür hacmi, gereken her örnek başına 10 ml eşdeğer hale getirilir. Örneğin, Şekil 1'deki deneysel tasarım için kültür hacmi 60 ml'dir.
   2. 30 °C'de sallayarak OD₆₀₀ nm = 0.05-0.1'e kadar yetiştir. İndüklenmemiş kontrol olarak kullanılacak 10 ml'lik bir örnek alınır ve kalan kültüre %0,1 arabinoz ekleyerek pKM1'den TetR-YFP üretimini indüke eder. Hem indüklenmemiş hem de indüklenen kültürleri artırmaya devam edin. 1 saat sonra, indüklenen kültürün her hücresinde tek bir odak noktasının bulunup bulunmadığını floresan mikroskopisi ile kontrol edin.
   3. İndüklenen hücrelerin bloklandığı doğrulanırsa (hücrelerin %70'inden fazlası tek bir odak noktasına sahip), OD₆₀₀nm kaydı ve 2-D jellerle analiz için 7,5 ml bir örnek alın. İndüklenmemiş kontrol kültüründen eşdeğer bir örnek alın.

Sonuçlar

Şekil 1: FROS Replikasyon Blok ve Serbest Bırakma Deneysel Prosedürünün Genel Bakışı. TetO dizisini taşıyan E. coli suşları 30 °C'de yetiştirilir. Hücreler OD₆₀₀nm 0.05'in üzerine ulaştığında, TetR-YFP üretimi arabinoz (ara;...

Malzemeler