Bakteriyel Gen Tespiti İçin Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon

Özet

Kaynak: Domesle, K. J. ve diğerleri. Hayvansal Gıda Salmonella'yı Taramak ve Kültür İzolasyonundan Salmonella'yı Doğrulamak için Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon. J. Vis. Exp. (2020).

Bu video, hedef bakteri genini sabit sıcaklıkta amplifikasyonla tespit etmek için döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) tekniğini göstermektedir. Reaksiyon karışımı, izotermal ana karışım, hedef gen için özel primerler ve DNA şablonları içeren örnekler eklenerek hazırlanır. Amplifikasyon bir LAMP cihazında başlatılır ve hedef genin varlığı doğrulanmak için gerçek zamanlı floresans izlenir.

Protokol

NOT: Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon karışımı, DNA polimeraz, tampon, magnezyum sülfat (MgSO₄), deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP'ler), primerler, DNA şablonu ve su içerir. İlk dört reaktif izotermal ana karışımda (Materyal Tablosu) bulunur. Astarlar önceden kendi içinde karıştırılır ve böylece 10 kez astar karışımı olur. DNA şablonları, tarama amacıyla hayvansal gıda örneklerinin zenginleştirme çorbalarından veya doğrulama amacıyla varsayılan Salmonella izolatlarının kültürlerinden hazırlanabilir. Ayrıca, her LAMP çalışmasında herhangi bir Salmonella referans suşundan alınan DNA, örneğin Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) ve şablonsuz kontrol (NTC; steril moleküler kalitede su) dahil edilir.

1. DNA şablonlarının hazırlanması

1. Hayvan gıdası zenginleştirmelerinden DNA şablonları hazırlamak için bu adımları izleyin.
   1. Aseptik olarak 25 g hayvan maması örneğini (örneğin, kuru kedi maması, kuru köpek maması, sığır mamı, at mamı, kümes hayvanı yemi ve domuz mamı) steril bir filtre torbasına (Materyal Tablosu) veya eşdeğerine alın. Kuluçka sırasında destek için poşeti büyük bir kap veya rafa yerleştirin.
   2. 225 mL steril tamponlu pepton suyu (BPW) ekleyin. Kısa bir el masajı ile iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 60 ± 5 dakika bekletin.
   3. Döndürerek iyice karıştırın ve pH bir test kağıdıyla belirleyin. Gerekirse pH 6.8 ± 0.2'ye ayarlayın ve steril 1 N sodyum hidroksit (NaOH) veya 1 N hidroklorik asit (HCl) ile kullanın. 35 ± 2 °C'de 24 ± 2 saat kuluçka yapın.
   4. Hayvansal gıda zenginleştirici su suyu içeren poşeti karıştırarak iyice karıştırın. Torbanın filtrelenmiş tarafından mikrosantrifüj tüpüne 1 mL aktarın. Kısa bir süreliğine Vortex.
   5. Numune hazırlama reaktif (Materyal Tablosu) kullanılarak DNA çıkarma işlemi aşağıdaki gibi.
      1. 900 x g sıcaklığında 1 dakika boyunca santrifüj yapın, böylece büyük parçacıklar çıkarılır ve süperatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarır.
      2. 16.000 x g sıcaklıkta 2 dakika santrifüj yapın ve üst kısmı atın.
      3. Pelleti örnek hazırlama reaktivinin 100 μL'sinde askıya alın ve kuru ısı bloğunda 100 ± 1 °C'de 10 dakika ısıtın.
      4. Oda sıcaklığına soğutun ve numune DNA ekstraktlarını -20 °C'de saklayın.
2. Varsayılan Salmonella kültürlerinden DNA şablonları hazırlamak için şu adımları izleyin.
   1. FDA'nın BAM 5. Bölüm D: Salmonella izolyasyonu uyarısına uygun tüm gıdalarda kültür izolasyonundan varsayılan Salmonella izolasyonları alın.
   2. Aşılan, varsayılan Salmonella izoleleri seçici olmayan bir agar plakasında (örneğin, kan agarı, besin agari ve triptikaz soya agarı) ve 35 ± 2 °C'de 24 ± 2 saat boyunca kuluçka içinde.
   3. Birkaç tek koloniyi 5 mL triptikaz soya suyu (TSB) veya beyin kalp infüzyonu (BHI) suyuna aktarın ve 35 ± 2 °C'de 16 ± 2 saat kuluçka yapın.
      NOT: Bu adım, varsayılan Salmonella kültürü safsa, isteğe bağlı olabilir. Bu durumda, DNA şablonları 5 mL TSB'de birkaç tek koloni askıya alınarak ve süspansiyonun 500 μL'sini 100 ± 1 °C'de kuru ısı bloğunda 10 dakika boyunca ısıtarak hazırlanabilir. Aşağıdaki 5. adımla devam edin.
   4. Gece kültüründen 500 μL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve kuru ısı bloğunda 100 ± 1 °C'de 10 dakika ısıtın.
   5. Oda sıcaklığına soğutun ve izole DNA ekstraktlarını -20 °C'de saklayın.
3. Pozitif kontrol DNA'sı hazırlamak için, varsayılan Salmonella kültürlerinden DNA şablonlarını bir ekstra seyreltme adımıyla hazırlayan benzer adımları izleyin.
   1. S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) veya herhangi bir Salmonella referans suşunu seçici olmayan agar plakasında (örneğin, kan agarı, besin agarı ve triptikaz soya agarı) aşılayın ve 35 ± 2 °C'de 24 ± 2 saat kuluçka yapın.
   2. Birkaç tek koloniyi 5 mL TSB veya BHI çorbasına aktarın ve 35 ± 2 °C'de 16 ± 2 saat kuluçka yapın, böylece ~10,9 CFU/mL'ye ulaşın.
   3. Gece kültürünü %0,1 pepton suyla seri olarak seyreltirin ve ~10⁷ CFU/mL elde edin.
   4. Bu seyreltmeden 500 μL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 100 ± 1 °C'de kuru bir ısı bloğunda 10 dakika ısıtın.
   5. Oda sıcaklığına soğutun ve pozitif kontrol DNA'sını -20 °C'de depolayın.

2. Atar karışımının hazırlanması (10x)

1. Standart tuz arıtma arıtımı ile ticari olarak sentezlenmiş LAMP primerleri (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF ve Sal4-LB) elde edin (Tablo 1). Her primerin (100 μM) stok çözeltilerini, primeri uygun miktarda steril moleküler kalitede suyla yeniden nemlendirerek hazırlayın. 10 saniye vorteksle iyi karıştırın ve -20 °C'de (uzun süreli depolama için -80 °C) saklayın.
2. Astar karışımını (10 kat) bir çalışma sayfasına göre hazırlayın (Tablo 2). Uygun hacimlerde primer stok çözeltileri ve steril moleküler kalitede suyu mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Tüm reaktifleri 10 saniye vortexle karıştırarak iyi karıştırın. 10x primer karışımını mikrosantrifüj tüpü başına 500 μL olarak alıp -20 °C'de sakla.

3. LAMP reaksiyonunun montajı

NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için, LAMP ana karışımının hazırlanması ve DNA şablonlarının eklenmesi için kullanılan alanların fiziksel olarak ayrılması şiddetle tavsiye edilir. Şekil 1 bir LAMP diyagramıdır.

1. Hazırlık ve çalışma kurulumu
   1. İzopropanol ve DNA ile DNAZ bozucu çözelti ile temiz bir tezgah (Materyal Tablosu). Pipetleri ve tüp şerit tutucularını (Materyal Tablosu) DNA ve DNaz bozucu çözeltiyle temizleyin.
   2. İzotermal ana karışımı, primer karışımı (10x), moleküler kalitede su, pozitif kontrol DNA'sı ve DNA şablonlarını oda sıcaklığında çözebilirsiniz.
   3. LAMP cihazını (Materyaller Tablosu) açın ve ana ekrana erişmek için açılış ekranına dokunun. Koşu oluşturmak için bu adımları takip edin.
      NOT: LAMP cihazının bir modelinde her blokta 8 örnek bulunan 2 blok (A ve B) bulunurken, başka bir modelde 8 örnek barındıran tek bir blok bulunur (Materyal Tablosu).
      1. LAMP+Anneal tuşuna dokunun ve örnek bilgiyi girmek için Düzenle'yi seçin.
         NOT: Varsayılan LAMP çalışma profili, 65 °C'de 30 dakika boyunca amplifikasyon ve 98 °C'den 80 °C'ye kadar anneal faz ile saniyede 0,05 °C azalmadan oluşur.
      2. Her örnek satırına dokunarak imleci aktive edin ve ilgili örnek bilgilerini girin; AB blok simgesini kullanarak iki LAMP enstrüman bloğu arasında geçiş yapın.
      3. Tüm örnek bilgiler girildiğinde Kontrol simgesine dokunun.
         NOT: Isteğe bağlı olarak, çalıştırma kurulumu ("Profil" olarak adlandırılır) ve örnek bilgilerini varsayılan LAMP çalışma profiliyle birlikte içeriyor) ileride kullanım için kaydedilebilir. Kaydet simgesine dokun ve profile benzersiz bir isim ver. Aynı örnek setini bir dahaki kez test ederken, kaydedilen profil kullanılarak yeni bir çalışma başlatılabilir. Ana ekranın sol alt köşesindeki Klasör simgesine dokunup kaydedilmiş profilleri yüklemek için Profil'i seçin.
2. LAMP reaksiyon montajı
   NOT: Her iki LAMP enstrüman bloğunu (A ve B, toplamda 16 örnek) kullanırken, 18 örnek için LAMP master mix'i hazırlayın. Sadece bir LAMP enstrüman bloğu kullanıyorsanız (toplamda 8 örnek), 10 örnek için LAMP master miksini hazırlayın. Diğer örnek sayıları için, pipetleme kaybına uygun şekilde ses seviyesini ayarlayın. Her LAMP koşusunda her zaman pozitif kontrol ve NTC ekleyin. Her örnekten bağımsız LAMP çalışmalarında tekrarlanan test edilmesi önerilir.
   1. LAMP ana karışımını bir çalışma sayfasına göre hazırlayın (Tablo 3). İzotermal ana karışım, primer karışımı ve moleküler kalitede suyu uygun hacimlerde mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve 3 saniye boyunca nazikçe girdabla girip yapın. Santrifüj yapın.
   2. Tüp şeridi şerit tutucusuna yerleştirin ve her kuyuya 23 μL LAMP ana karışımı dağıtın.
   3. Tüm DNA şablonlarını girdab ve santrifüjü kısa süreliğine yapın. Uygun kuyuya 2 μL DNA şablonu ekleyin ve sıkıca kapalayın.
   4. Tüp şeridini tutucudan çıkarın ve bileğinizi sallayarak tüm reaktiflerin tüpün dibinde biriktiğinden emin olun.
   5. Tüp şeridini LAMP alet blokuna yükleyin, kapağı kapatmadan önce kapakların sabitliğinden emin olun.

4. LAMBA Koşusu

NOT: LAMP çalışması sırasında, floresan okumaları FAM kanalı kullanılarak alınır. Zaman-tepe değerleri (Tmax; min), floresans oranı amplifikasyon hız eğrisinin maksimum değerine ulaştığında cihaz tarafından otomatik olarak belirlenir. Tm (°C), nihai amplifikasyon ürünün erime/tavlama sıcaklığıdır.

1. Ekranın sağ üst köşesindeki Run simgesine tıklayın ve LAMP koşusunu başlatmak için tüp şerit(lerini) içeren blok(lar)ı seçin.
2. Tepki devam ederken, isteğe bağlı olarak, LAMP çalışması sırasında çeşitli parametrelerin dinamik değişikliklerini görmek için Sıcaklık, Güçlendirme ve Anneal sekmelerine dokunabilirsiniz.
3. Çalışma tamamlandıktan sonra, Amplifikasyon ve Anneal sekmelerine dokunarak tam amplifikasyon ve anneal eğrileri görebilirsiniz, sonuçları görmek için Sonuçlar sekmesine dokunun.
4. Kayıt tutmak isteğe bağlı olarak, ekranın sol üst köşesinde bulunan çalışma numarasını "enstrüman seri number_run numarası" formatında kaydedebilirsiniz, örneğin "GEN2-2209_0030".

Tablo 1: Hayvan masında Salmonella'yı taramak ve kültür izolasyonundan Salmonella'yı doğrulamak için LAMP primerleri . Astarlar, Salmonella invA dizisi (GenBank erişim numarası M90846) temelinde tasarlanmıştır.

Giriş adı	Açıklama	Dizisi (5'-3')	Uzunluk (bp)
Sal4-F3	Ön dış primer	GAACGTGTCGGGGAAGTC	18
Sal4-B3	Ters dış astar	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Ön iç primer	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Geriye dönük iç primer	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Loop forward primer	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Döngü geriye doğru astarlama	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Tablo 2: LAMP astarlık karışımını hazırlamak için çalışma sayfası (10x). Astarlar Tablo 1'de listelenmiştir.

Parça	Stok konc. (μM)	Astar karışımı konc. (μM)	Hacim (μL)
Sal4-F3 astar	100	1	10
Sal4-B3 astar	100	1	10
Sal4-FIP primer	100	18	180
Sal4-BIP astar	100	18	180
Sal4-LF astar	100	10	100
Sal4-LB astar	100	10	100
Moleküler dereceli su	YOK	YOK	420
Toplam	YOK	YOK	1000

Tablo 3: LAMP reaksiyon karışımını hazırlamak için çalışma sayfası. Astar karışımı (10x), Tablo 2'ye göre Tablo 1'de listelenen primerlerin stok çözeltileriyle hazırlanır.

Parça	Çalışıyor koncüm.	Son tepki konc.	Örnek başına hacim (μL)	18 örnek (μL) için hacim	10 örnek için hacim (μL)
ISO-001 izotermal ana karışımı	1.67x	1x	15	270	150
Astar karışımı	10x	1x	2.5	45	25
Moleküler kalitede su	YOK	YOK	5.5	99	55
Master mix alt toplamı	YOK	YOK	23	414	230
DNA şablonu	YOK	YOK	2	YOK	YOK

Sonuçlar

Şekil 1: Salmonella LAMP iş akışının şematik diyagramı.

Malzemeler