Floresan Biyomoleküllerin Bakteriyel Hücrelere Elektroporasyon Tabanlı Teslimatı

Özet

Kaynak: Aigrain, L. ve diğerleri. Elektroporasyon yoluyla canlı mikroorganizmalarda floresan biyomoleküllerin içselleştirilmesi ve gözlemlenmesi. J. Vis. Exp. (2015)

Video, elektroporasyon kullanılarak floresan biyomoleküllerin elektro yetkili mikrobiyal hücrelere nasıl teslim edildiğini gösteriyor. Süreç, florofor etiketli DNA veya proteinlerin soğutulmuş hücre süspansiyonuna eklenmesiyle başlar. Daha sonra yüksek voltajlı bir darbe uygulanarak geçici membran gözenekleri oluşturulur ve biyomolekülün sitoplazmaya girişini sağlar. Kurtarıldıktan sonra, hücreler içselleştirilmeyen veya yüzeye bağlı moleküllerin uzaklaştırılması için yıkama ve filtreleme geçirilir. Son olarak, etiketlenmiş hücreler hücre içi bileşenleri görselleştirmek için floresans görüntüleme için monte edilir.

Protokol

1. Elektroporasyon

1. Kuluçka
   1. Düşük tuzlu tamponda saklanan (< 50 mM tuz) etiketlenmiş moleküllerin, yetkin hücrelerden oluşan tek bir aliquot (20 μl bakteri veya 50 μl maya) ile 5 μl kadar etiketlenmiş molekülleri birleştirin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Stok çözeltilerindeki floresan etiketli moleküllerin konsantrasyonu ve dolayısıyla elektroporasyondan önce hücreye eklenen etiketlenmiş molekül miktarı, yük verimliliğiyle doğrudan ilişkilidir (Şekil 1 ve Tartışma). Bazı proteinler düşük tuz koşullarıyla daha az uyumlu olduğundan, depolama tamponundaki tuz konsantrasyonu artabilir, ancak elektroporasyondan önce hücrelere eklenen etiketlenmiş moleküllerin hacmi azaltılmalıdır.
   2. Hücreler ve etiketlenmiş biyomoleküllerin karışımını, bakteri ve maya için sırasıyla 0,1 ve 0,2 cm aralıklı önceden soğutulmuş elektroporasyon küvetine aktarın. Küreti tezgaha hafifçe vurarak çözelti olası kabarcıkları çıkarabilirsiniz.
   3. Küveti elektroporatöre yerleştirin ve çözeltiye yüksek voltajlı bir elektrik darbesi uygulayın (0,9 ila 1,8 kV/cm, voltaj seçimiyle ilgili daha fazla detay için Tartışmaya bakınız). Böyle bir darbe, hücre zarlarında geçici gözenekler oluşturur ve işaretlenmiş biyomoleküllerin hücrelere yayılmasına olanak tanır.
   4. Elektroporatörde gösterilen zaman sabitinin 4 ila 6 ms arasında olduğundan emin olun. Daha düşük zaman sabitleri genellikle çok yüksek tuz konsantrasyonu ve/veya küvette kabarcık bulunmasından kaynaklanır ve hücrelerin çok düşük veya hiç yüklenmemesine yol açar.
2. Kurtarma
   1. Elektroporasyondan hemen sonra, hücrelere 500 μl zengin ortam eklenin; örneğin Katabolit baskılı Süper Optimal Et Suyu (SOC), EZ Zengin Tanımlanmış Ortam, maya ekstraktı Pepton Dekstroz (YPD) veya herhangi bir zengin ortam ekleyin.
   2. Örneği bakteriler için 37 °C, maya için 29 °C'de 2 ila 10 dakika kuluçka yapın. Kullanıcı, elektroporasyondan sonra hücrelerin büyüme ve bölünme yüzdesini değerlendirmek istediği canlılık ölçümlerinde, ilk hücre bölünmesinden önceki gecikmeleri gözlemlediğimiz için daha uzun bir iyileşme süresi (1 saate kadar) kullanın.
3. Yıkama adımları
   1. Hücreleri 3300 x g ve 4 °C sıcaklıkta 1 dakika boyunca döndürerek içselleştirilmemiş biyomolekülleri temizlemek için yıkayın. Üst maddeyi atın ve hücreleri 500 μl Fosfat-Tamponlu Salin (PBS) içinde yeniden süzülür.
      NOT: Her örnek için, aynı miktarda etiketlenmiş biyomoleküllerle kuluçka edilmiş ancak ana örnekle aynı şekilde elektroporlanıp yıkanmamış hücrelerin negatif kontrolünü hazırlayın.
   2. Önceki adımları 3 kez tekrarlayın.
   3. Protein içselleştirme durumunda, dikkat çeken etiketlenen proteinin özellikleri ve davranışına bağlı olarak yıkama prosedürü optimize edilir. Aşağıdaki adımlar olası optimizasyonlara örneklerdir:
      1. İlk üç yıkama döngüsünü 100 mM NaCl ve %0,005 Triton X-100 içeren PBS kullanarak dış hücre zarına yapışabilecek içselleştirilmeyen proteinleri çıkararak gerçekleştirin.
         1. Elektroporlu hücreleri, 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpünün içine yerleştirilmiş 0,22 μm gözenek çaplı filtreyle filtreleyin; elektroporlu hücreler filtreye pipet edildiğinde. 800 x g ve 4 °C sıcaklıkta 3 dakika boyunca aşağı döndürün. Akışı atın. Hücrelerin üzerine 500 μl yeni PBS ekleyin ve onları tekrar tekrar döndürün, ardından bu adımları bir kez tekrarlayın.
      2. İlk yıkama döngüsünde az miktarda proteaz K (500 μl PBS'de 10 ng) ekleyin, böylece içselleştirilmeyen proteinler sindirim yapılabilir.
   4. Hücreleri 3300 x g ve 4 °C sıcaklıkta 1 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı atın ve hücreleri 150 μl PBS ile yeniden süspansiyona alın.
   5. Yüklü hücre çözeltisini, üst kapak kaygıcını çıkararak ve hücre süspansiyon damlasından damla damla yayarak agaroz pedine yayın. Kullanılmamış, yanmış bir kapak örtünü (No 1.5 kalınlığı, mikroskop objektif spesifikasyonuna uygun) padin üstüne yerleştirin ve kaydırmaya çok nazikçe basın.
   6. Elektroporlu hücreleri ışıktan koruyun; pedleri opak bir kutuda saklayarak ve farklı örnekleri görüntülemek.

Sonuçlar

Şekil 1: Foto ağartma analiziyle içselleştirilmiş moleküllerin sayısının sayımı. (A) Tek hücreli foto ağartma analizi. Flüoresans yoğunluğu zaman izlerine örnekler (mavi: ham veri; kırmızı: uyum; insetler: ağartmadan önce ...

Malzemeler