Canlı Hücre Görüntüleme İçin Myxococcus Xanthus Örneklerinin Hazırlanması

Özet

Kaynak: Schumacher, D. ve diğerleri. Yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus'un tam vejetatif hücre döngüsünün floresans canlı hücre görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, yavaş büyüyen bir toprak bakterisi olan Myxococcus xanthus'un hazırlanma ve görüntülemesini gösteriyor. Kültür, floresan mikrokürelerle örtülü bir örtü üzerine uygulanır ve hidrasyon ile besin tedarikini desteklemek için önceden ısıtılmış agaroz yastığı ile örtülür. Bu düzen, bakteriyel hücre bölünmesi sırasında hücresel süreçlerin uzun vadeli, zaman geçişli canlı görüntülenmesini sağlar.

Protokol

1. Mikroskopi Örneklerinin Hazırlanması

Not: Mikroskopi ile incelenecek hücreler mikroskop kapak kapağına yerleştirilir ve ardından besinler içeren agaroz pediyle kaplanır. Kapak kasası, mekanik destek sağlamak için plastik veya metal bir çerçeveye yapıştırılır. Mikroskopi hazırlığı içinde, 2.1 - 2.3 adımlarında açıklandığı gibi önceden %1 agaroz/TPM/%0,2 CTT içeren büyük bir pad hazırlanmalıdır. Burada kullanılan belirli ürünler için lütfen Materyaller Tablosu'na da bakınız.

1. 500 mL TPM tamponu (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM KH₂PO₄ pH 7.6, 8 mM MgSO₄) hazırlayın ve şişe kapağı filtre ile otoklav veya filtre sterilizasyonu yapın.

NOT: Steril tampon oda sıcaklığında birkaç ay boyunca saklanabilir.

2. %0,2 CTT içeren %1 agaroz mikroskopisi çözeltisi hazırlayın (1 g agarozu 80 mL TPM tamponu ve 20 mL %1 CTT ortamı ile karıştırın). Agaroz eriyene kadar mikrodalga fırında ısıtın.

NOT: %0,2 CTT, hücrelerin büyümesini sağlamak ve açlığı önlemek için yeterlidir. Mikroskopik ortamda daha yüksek CTT konsantrasyonu, yüksek arka plan floresansına yol açar.

3. Petri kabını erimiş agarozla 0,5 cm kalınlıkta doldurun (11,5 cm x 11,5 cm kare Petri kabı için yaklaşık 60 mL erimiş agaroz gereklidir) ve oda sıcaklığına soğumasına izin verin.

NOT: Agarose ped, nemli bir ortamda 4 °C sıcaklıkta 2 güne kadar saklanabilir.

1. Kullanımdan önce %1 agarose/TPM/%0.2 CTT pedini 32 °C'de en az 15 dakika önceden ısıtın.

NOT: Hücreleri mikroskopiye hazırlamak için 2.4 - 2.8 numaralı adımları takip edin.

4. Steril cam bir kapak (60 mm x 22 mm, kalınlığı: 0,7 mm) ortasında delik olan plastik veya metal bir çerçeveye yerleştirin (Şekil 1A); Bu çerçeve, ince kaplama kayması için mekanik destek olarak hizmet verir ve mikroskopi sırasında kaymayı azaltmaya yardımcı olur. Kapak kaymasını çerçeveye bantla sabitleyin.

1. Çerçeveyi hazırlamak için, 1 mm kalınlığında metal plakadan 75 mm × 25 mm çerçeve kesin, ardından ortada uygun boyutta bir delik (bu deneyde 20 mm × 30 mm) kesin.

5. Örtü sayfasına 10 - 20 μL üssel olarak büyüyen M. xanthus hücresi ekleyin.

6. Hücrelere 0,5 μm mikroküreler ekleyerek zaman geçişli kayıtlarda hücrelerin veya proteinlerin izini kolaylaştırmak için fiducial belirteç olarak ekleyin.

1. Mikroküreleri TPM tamponunda 1:100 seyreltin ve 4 °C'de birkaç aya kadar saklayın. Kullanmadan önce iyice çalkalayın ve hücrelere seyreltilmiş mikrokürelerden 5 - 10 μL ekleyin.

NOT: Burada, tüm yaygın mavi, yeşil, sarı ve kırmızı floresan kanallarda floresan olan mikroküreler kullanılmıştır.

7. Büyük önceden ısıtılmış %1 agaroz/TPM/%0,2 CTT pedinin örtü kapağının yaklaşık boyutunda küçük bir ped kesin ve hücrelerin üzerine yerleştirin (Şekil 1B). Buharlaşmayı önlemek ve hücreleri nemli ortamda tutmak için %1 agaroz/TPM/%0,2 CTT agaroz pedinin üzerine bir örtü kuşağı yerleştirin.

NOT: Sadece örtü kaydırması bile en az 2 saat boyunca önemli bir buharlaşmanı önler. Daha uzun zaman geçişli kayıtlar için, %1 agaroz/TPM/%0,2 CTT ped ve kapak sandviçi buharlaşmayı önlemek için parafin filmiyle mühürlenmelidir.

8. Mikroskopi örneğini 32 °C'de 15 - 20 dakika kuluçka altına geçirerek hücrelerin agaroz pedinin altına tutunmasını sağlar. Sonra zaman geçişli mikroskopi kayıtlarına başlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Bu çalışma boyunca kullanılan deneysel düzenin şeması. (A) Numune için bir destek olarak metal veya plastik bir çerçeve kullanılır. Numunenin hareketini azaltmak için metal çerçeveye bantla bir kapak sabitlenir. (

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AFC ile DMI6000B	Leica mikrosistemleri	11888945	Adaptif odak kontrolüne sahip otomatik ters geniş alanlı floresan mikroskobu
Evrensel montaj çerçevesi	Leica mikrosistemleri	11532338	Farklı örneklem boyutları için sahne tutucu
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 yağ PH3	Leica mikrosistemleri	11506197	Faz kontrastı hedefi
Orca Flash 4.0 kamera	Hamamatsu	11532952	Fotoğraf alımı için 4.0 megapiksel sCMOS kamera
Filtre seti TXR ET, k	Leica mikrosistemleri	11504170	Floresans filtre seti, Ex: 560/40 Em: 645/75
Filtre seti L5 ET, k	Leica mikrosistemleri	11504166	Floresans filtre seti, örneğin: 480/40 Em: 527/30
Filtre seti YFP ET, k	Leica mikrosistemleri	11504165	Floresan filtre seti, Ex: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	Önce	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Etkileşimli kontrol merkezi ile mikroskop otomasyon kontrolörü
EL 6000 ışık kaynağı	Leica mikrosistemleri	11504115	Dış floresans ışık kaynağı
Kuluçka Makinesi BLX Black	Pecon	11532830	mikroskobu çevreleyen siyah kuluçka odası
Tempcontrol 37-2 dijital	Leica mikrosistemleri	11521719	İnkubasyon odası için otomatik sıcaklık kontrolü
Gentmisin sülfat	Carl Roth	233.4	Gentamisin
Oksitetrasilin dihidrat	Sigma Aldrich	201-212-8	Oksitetrasiklin
Kanamisin sülfat	Carl Roth	T832.3	Kanamycin
Filtropur BT25 0.2 şişe kapak filtresi	Sarstedt	831,822,101	Tamponların sterilizasyonu için şişe kapağı filtre
Deckgläser	VWR	630-1592	Cam kapağı kaydırması (60 x 22 mm, kalınlık: 0,7 mm)
Seakem LE agarose	Lonza	50004	Mikroskopi slaytları için agaroz
Leica Metamorph AF	Leica mikrosistemleri	11640901	Mikroskop kontrol yazılımı ve resim analizi için yazılım
Tetraspeck Microsperes, 0,5 μm	ThermoFisher	T7281	Floresan mikroküreler
Petri kabı	Greiner Bio-one	688102	120 mm x 120 mm x 17 mm kare petri kabı agarose pedleri için
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casitone
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
Tris(hidroksimetil)-aminometan	Carl Roth	AE15.2	Tris
Magnezyum sülfat heptahidrat	Carl Roth	P027.2	Magnezyum sülfat
Potasyum dihidrojen fosfat p.a.	Carl Roth	3904.1	Potasyum dihidrojen fosfat
1% CTT ortamı: %1 (w/v) BD Bacto™ kasiton, 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potasyum fosfat tamponu pH 7.6, 8 mM MgSO₄			M. xanthus için yetiştirme ortamı
TPM tamponu: 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potasyum fosfat tamponu pH 7.6, 8 mM MgSO₄			M. xanthus için mikroskopi slaytlarının hazırlanması için tampon