Mikroplaka okuyucu kullanarak bakteri büyümesinin hassas ve yüksek verimli analizi

Özet

Kaynak: Kurokawa, M. ve diğerleri. Bakteriyel Büyümenin Kesin, Yüksek Verimli Analizi. J. Vis. Exp. (2017)

Bu video, mikroplaka okuyucu kullanılarak bakteri büyümesinin yüksek verimli niceliklendirilmesini gösteriyor. Kültür hazırlığı, optik yoğunluk ölçümü ve büyüme dinamiklerinin analizi aşamalarını özetler.

Protokol

1. Büyümenin gerçek zamanlı kaydı
   1. Aşılanmış kültür örneklerinin 96 kuyu plakasındaki konumlarını göstermek için 96 kuyu plaka piktogramı (8 × 12 tablo) çizin. Tabloyu yazdırın ve deney için referans olarak kullanın.
      NOT: Mikroplakanın kenarlarında bulunan kuyular buharlaşma nedeniyle sadece boş ortam içermelidir.
   2. Sterilize edilmiş 96 kuyuyuk düz tabanlı mikroplaka, kapaklı bir mikroplaka, P-1000, 1000-μL pipet uçları, P-200, 200-μL pipet uçları, birkaç 1,5-mL mikrotüp, 8 çok kanallı pipet, sterilize edilmiş bir reaktif rezervuar, oda sıcaklığında M63 ve Escherichia coli gliserol stoklarını temiz bir tezgaha yerleştirin.
   3. Reaktif rezervuarına yaklaşık 25 mL M63 ekleyin. Bu rezervuar dipçiğini aşağıdaki tüm adımlar için kullanın.
   4. Seri seyreltme yapmak için mikrotüplere 900 μL M63 eklenir.
   5. Gliserol stokunu oda sıcaklığında çöz. Eritilmiş gliserol stokuna ve girdabına 900 μL M63 ekleyin. Bu, orijinal gliserol stokunun 10 kat seyrelmesine yol açar.
   6. 100 μL seyreltme 100 μL M63 ve girdap içeren başka bir mikrotübe aktarılır. Bu, 100 kat seyreltme ile sonuçlanır.
   7. 1.6. adımı istenen seyreltme sayısına ulaşana kadar tekrarlayın.
   8. Mikroplakanın kenarındaki kuyular 8 kanallı pipet (P-200) kullanılarak 200 μL M63 ile doldurulur.
      NOT: Bu kuyular boşluk olarak kullanılabilir.
   9. 1.4 - 1.7. adımlarda hazırlanmış her seyreltilmiş örnekten 200 μL'yi, referans tablosuna göre mikroplaka kuyruklarına yükleyin (adım 1.1). Sulandırılmış örnekleri yüklemeden önce girdabla doldurun ve aynı örneği plaka üzerinde farklı noktalarda birden fazla kuyuya yükleyin.
   10. 96 kuyruklu mikroplakayı plaka okuyucuya yerleştirin.
   11. "Görev Yöneticisi"nden "Şimdi Oku" seçeneğini aç ve programı seç. Ölçmeye başlamak için "OK" tuşuna tıklayın. Kaydı veri analizi için yeni bir deneysel dosya olarak kaydedin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dipotasyum fosfat	Wako	164-04295
Monopotasyum fosfat	Wako	166-04255
Amonyum sülfat	Wako	019-03435
Magnezyum sülfat heptahidrat	Wako	138-00415
Tiamin-HÇL	Wako	201-00852
Glikoz	Wako	049-31165
Hcl	Wako	080-01066
Demir (II) sülfat heptahidrat	Wako	094-01082
KOH	Wako	168-21815
Gliserol	Wako	075-00611
Pipet uçları, 200 μL	WATSON	110-705Y
Pipet uçları, 1.000 μL	WATSON	110-8040
Mikrotüp (1.5 mL)	WATSON	131-715C
8 Çok kanallı pipet	WATSON	NT-8200
Pasorina karıştırıcı	TEK KİMİ	2-4990-02
Cam silindir (200 mL)	TEK KİMİ	1-8562-07
Hassas pH ölçer	TEK KİMİ	AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200	GILSON	1-6855-05
Pipetman P-1000	GILSON	1-6855-06
Mikrotüp standı	BM Biyografisi	801-02Y
Girdap	BM Biyografisi	BM-V1
Corning Costar 96 kuyu mikroplaka, kapaklı (Düz taban, şeffaf)	Sigma-Aldrich	Corning, 3370
Corning Costar reaktif rezervuarı (50 mL)	Sigma-Aldrich	Corning, 4870
EPOCH2	BioTek	2014-EP2-002 / EPOCH2T
BIO temiz tezgah	Panasonic	MCV-B131F
Bakteriyel suşlar	Gerim bankası organizasyonu; Japonya'da Ulusal Biyolojik Kaynak Projesi (NBRP)