$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Termal Açılan Malat Dehidrojenaz (MDH) kullanarak Chaperon Aktivite Testi
NOT: Arıtılmış HdeB'nin, farklı pH değerlerinde termal açılan domuz mitokondriyal malatı dehidrojenazının (MDH) toplanmasına etkisi aşağıda açıklandığı gibi izlenmiştir. Tüm listelenen protein konsantrasyonları monomer konsantrasyonuna atıfta bulunur.
- MDH hazırlamak için, MDH'yi gece boyunca 4 °C'de 4 L tampon C (50 mM potasyum fosfat, 50 mM sodyum klorür (NaCl), pH 7.5) karşısında diyaalize edin ve proteini 30 kDa moleküler ağırlık kesimi ile santrifüj filtre üniteleriyle yaklaşık 100 μM'ye konsantre edin.
NOT: MDH'nin amonyum sülfat çözeltisi olarak verildiği için MDH'nin dikkatli diyalizi gereklidir. - Agregaları çıkarmak için, proteini 20.000 x g ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjle yapın. MDH konsantrasyonu 280 nm (ε 280 nm= 7.950 M-1 cm-1) absorbansıyla belirlenir. 50 μl MDH alikotu hazırlayın ve alikotları depolamak için flaş dondurun.
- 1 ml'lik kuvars küvetini, sıcaklık kontrollü numune tutucuları ve karıştırıcılarla donatılmış bir floresans spektrofotometresine yerleştirin. λex/em 350 nm olarak ayarlan.
- İstenilen pH değerlerinde (burada: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 ve pH 5.0) önceden ısıtılmış (43 °C) tampon D (150 mM potasyum fosfat, 150 mM NaCl) küvete uygun hacimleri ekleyerek küvet tutucusunun sıcaklığını 43 °C'ye ayarlayın. Toplam hacim 1.000 μl'dir.
- Tampona 12,5 μM HdeB (veya alternatif olarak, tampon kontrolü için aynı hacimli HdeB depolama tamponu hacmi) eklenir ve ardından 0,5 μM MDH eklenir. Işık saçılmasını izlemeye başlayın. MDH'nin yeterince açılmasını sağlamak için reaksiyonu 360 saniye kuluçka edin.
- 2 M tamponlanmamışK 2HPO 4 hacmi ekleyerek pH değerini 7'ye yükseltin ve ışık saçılmasını 440 saniye daha kaydetmeye devam edin.
- Nötrasyondan sonra (bundan sonra 500 saniye, MDH'nin maksimum ışık saçılması gözlemlendiği zaman) refaperonun yokluğunda kaydedilen MDH toplama kapsamını %100'e ayarlayın. HdeB'nin her belirtilen pH değerinde HdeB yokluğunda MDH'nin ışık saçılma sinyali olarak HdeB aktivitesini normalize edin.