Asit Stresi Altında E. coli'de Asitle Aktive Edilmiş Bir Şaperonun Koruyucu Rolünün Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Dahl, J. ve diğerleri. Escherichia coli Chaperone HdeB'nin pH-Bağımlı Aktivitesinin Tespiti In Vitro ve In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, asit stresi sırasında asitle aktive edilmiş bir şaperonun koruyucu etkisini değerlendirmek için rekombinant E. coli kültürlerinin kullanımını göstermektedir. Bakteriyel büyüme izleme, kontrol koşullarına kıyasla şaperon eksprese eden kültürlerde daha iyi hayatta kalma oranını ortaya koymakta olup, stres koşullarında protein stabilizasyonunda şaperonların rolünü vurgulamaktadır.

Protokol

1. Chaperone HdeB Aşırı İfadesinin E. coli Asit Stresi Altında Hayatta Kalma Üzerindeki Etkisi

NOT: E. coli MG1655 genomik DNA'sı standart protokol kullanılarak izole edilmiştir.

1. E. coli MG1655'ten chaperon hdeB'yi PCR ile hdeB, hdeBH I-rev GGT, GGT, CTG, GGA TCC, TTA ATT, CGG, CAA, GTC, ATT ve hdeB-EcoR, I-fw GGT, GCC, GAA, TTC, AGG AGG, CGC ATG AAT, ATT, TCA, CTCT CTC C.
2. PCR reaksiyonunu 50 μl'de şu şekilde kurun: 10 μl 5x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP, 0,5 μM primer JUD2, 0,5 μM primer JUD5, 150 ng genomik DNA MG1655, 0,5 μl DNA polimeraz,_{ddH 2}O eklenerek 50 μl.
3. hdeB'nin amplifikasyonunu aşağıdaki şekilde gerçekleştirin: Adım 1: 95 °C'de 5 dakika, 1 döngü; adım 2: 95 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye, 72 °C'de 30 saniye, 40 döngü; Adım 3: 72 °C'de 10 dakika.
4. Krestriksiyon noktası klonlama için standart yöntemlerle plazmid pBAD18'in EcoRI ve BamHI bölgelerine PCR parçasını klonlamak. Plazmidi üreticinin talimatlarına göre plazmid arıtma kiti ile arındırın. Ortaya çıkan plazmid dizileme ile doğrulan.
5. HdeB'yi ifade eden plazmidi veya boş vektör kontrol pBAD18'i suş BB7224'e dönüştürün (ΔrpoH) (genotip: F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺) kimyasal olarak yetkin hücreler kullanılarak.
   NOT: Bu suş sıcaklığa duyarlıdır.
6. 45 saniyelik 42 °C'de ısı şokundan sonra ve kaplamadan önce, hücreleri 30 °C ve 200 rpm'de kuluçka yapın. Pozitif klonların tek koloni çizgilerini gerçekleştirin ve gece boyunca 30 °C'de kuluçka yapın. 50 ml LB_Amp'de gece boyunca kültür hazırlayın ve hücreleri 200 rpm ile 30 °C'de yetiştirin.
7. Gece kültürlerini 40 kat 25 ml LB_Amp'e seyreldin ve bakteriyi %0,5 arabinoz (Ara) varlığında, 30 °C ve 200 rpm'de %0,5 arabinoza (Ara) ile O.D.600nm = 1,0'a kadar büyüterek HdeB protein ekspresyonunu indükleyin.
8. pH kaydırma deneyleri için, LB_Amp+Ara kullanarak hücreleri 0.5 %_600nm'ye kadar seyreltin ve ilgili pH değerlerine (burada: pH 2.0, pH 3.0 ve pH 4.0) uygun 5 M HCl hacimleri ekleyerek ayarlayın.
9. Belirtilen zaman noktalarından sonra (pH 2, 1 dakika; pH 3, 2,5 dakika; pH 4, 30 dakika), kültürleri uygun hacimde 5 M NaOH ekleyerek nötralize edin.
10. Nötralize edilmiş kültürlerin sıvı kültürdeki büyümesini 30 °C'de 12 saat boyunca aşırı doz ölçümleriyle izleyin.

Malzemeler