Bu video, balık-patojenik bakteriden türetilen floresan etiketli değişken sayı tandem tekrarı (VNTR) amplikonlarının ayrılma prosedürünü göstermekte, bakteriyel tanımlama için boyuta özgü elektroferogram profilleri oluşturmak amacıyla kapiller elektroforez kullanılarak sunulmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Değişken Sayıda Tandem Tekrarı (VNTR) Analiziyle Balık Patojenlerinin Tespiti
432 görüntülenme
⸱
28 Kasım 2025
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Kapiller Elektroforez Kurulumu ve Çalışma Koşulları
- PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu) amplikonlarının doğrulanmasının ardından, PCR ürünlerini saflaştırılmış suda 1:10 (v/v) oranında seyreltin. Kısa süreliğine sızdırdırıp karıştırın ve santrifüj yapın.
- Bir duman dolabında çalışırken, PCR ürünü için standart olarak 9 μL formamid ve 0,5 μL boyut içeren bir ana karışım hacmi hazırlayın (%10 fazla hacme izin verin). Vortex, mevcut CE (kapiller elektroforez) sistemine uygun bir plakada 9,5 μL kuyruklara kısa bir süreliğine dağıtır ve ardından 0,5 μL seyreltilmiş PCR ürünü eklenir. Kısa süreliğine sızdırdırıp karıştırın ve santrifüj yapın.
DİKKAT: Dikkatli davranın. Formamidin suyla karıştırılması, toksik olan formik asit oluşturur. - PCR termal döngücü kullanarak, örnekleri 95 °C'de 3 dakika boyunca denatüre edin ve ardından süresiz olarak 4 °C'ye soğutun. Kısa bir süreliğine santrifüj yapın ve plakayı üreticinin talimatlarına göre kalibre edilmiş bir CE sistemine yükleyin.
- Seçtiğiniz cihaz için uygun reaktiflerle ve aşağıdaki ayarlarda parça analizi CE yapın: 60 °C; 1,6 kV (32 V/cm) hızında 5 saniyelik enjeksiyonlar; 15 kV (300 V/cm) ile 32 dakika çalışma süresi. 24 kuyunun 24 kuyunun (50 cm) CE fragment analizi genellikle yaklaşık 50 dakika sürer.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Avant 3500xL Genetik Analizörü | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Kapiller elektroforez parça analizi için kullanılır. |
| BioNumerics7 modülleri | Uygulamalı Matematik | NA | MLVA verilerinden Minimum Spanning ağaçları oluşturmak için kullanılır. |
| Santrifüj(ler) | Tercihine göre. | NA | |
| Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | DNA çıkarımı sırasında kullanılan santrifüj tüpleri. |
| Dondurucu | Tercihine göre. | NA | |
| Duman dolabı | Tercihine göre. | NA | |
| GeneMapper Yazılımı 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Kapiller elektroforezden elektroferogramları okumak için kullanılır. |
| GeneScan 600 LIZ boya Boyutu Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Kapiler elektroforez sırasında kullanılan boyut standardı. |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Kapiller elektroforezi sırasında kullanılan deionize formamid. Çalışma ayaklarını hazırla. |
| Milli-Q su | NA | NA | PCR ve kapiler elektroforezi sırasında kullanılan saf su. Standart tarif; Şirket içinde üretildi. |
| Çoklu PCR Plus Kiti | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR termal döngücü | Tercihine göre. | NA | |
| 3500 Dx/3500xL Dx Genetik Analizörleri için POP-7 Polimeri | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Kapiler elektroforez sırasında kullanılan ayırma matrisi. |
| Saf kültür Yersinia ruckeri | NA | NA | Örneğin, kriyokonserve veya taze olarak. |
| RNase-içermeyen su | Qiagen | NA | İçinde: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) tamponu | NA | NA | Standart tarif; Şirket içinde üretildi. |
| Tripsin soya agar/sığır kan agari | NA | NA | Standart tarif; Şirket içinde üretildi. |
| Vortexer | Tercihine göre. | NA |
