Değişken Sayıda Tandem Tekrarı (VNTR) Analiziyle Balık Patojenlerinin Tespiti

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Gulla, S. ve diğerleri. Çoklu lokus değişken sayı Tandem tekrarı Balık patojenik bakteri Yersinia ruckeri'nin Multiplex PCR ve Kapiller Elektroforez ile analizi. J. Vis. Exp. (2019).

Bu video, balık-patojenik bakteriden türetilen floresan etiketli değişken sayı tandem tekrarı (VNTR) amplikonlarının ayrılma prosedürünü göstermekte, bakteriyel tanımlama için boyuta özgü elektroferogram profilleri oluşturmak amacıyla kapiller elektroforez kullanılarak sunulmaktadır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kapiller Elektroforez Kurulumu ve Çalışma Koşulları

PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu) amplikonlarının doğrulanmasının ardından, PCR ürünlerini saflaştırılmış suda 1:10 (v/v) oranında seyreltin. Kısa süreliğine sızdırdırıp karıştırın ve santrifüj yapın.
Bir duman dolabında çalışırken, PCR ürünü için standart olarak 9 μL formamid ve 0,5 μL boyut içeren bir ana karışım hacmi hazırlayın (%10 fazla hacme izin verin). Vortex, mevcut CE (kapiller elektroforez) sistemine uygun bir plakada 9,5 μL kuyruklara kısa bir süreliğine dağıtır ve ardından 0,5 μL seyreltilmiş PCR ürünü eklenir. Kısa süreliğine sızdırdırıp karıştırın ve santrifüj yapın.
DİKKAT: Dik....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Avant 3500xL Genetik Analizörü	Thermo Fisher Scientific	A30469	Kapiller elektroforez parça analizi için kullanılır.
BioNumerics7 modülleri	Uygulamalı Matematik	NA	MLVA verilerinden Minimum Spanning ağaçları oluşturmak için kullanılır.
Santrifüj(ler)	Tercihine göre.	NA
Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	DNA çıkarımı sırasında kullanılan santrifüj tüpleri.
Dondurucu	Tercihine göre.	NA
Duman dolabı	Tercihine göre.	NA
GeneMapper Yazılımı 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Kapiller elektroforezden elektroferogramları okumak için kullanılır.
GeneScan 600 LIZ boya Boyutu Standard v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Kapiler elektroforez sırasında kullanılan boyut standardı.
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Kapiller elektroforezi sırasında kullanılan deionize formamid. Çalışma ayaklarını hazırla.
Milli-Q su	NA	NA	PCR ve kapiler elektroforezi sırasında kullanılan saf su. Standart tarif; Şirket içinde üretildi.
Çoklu PCR Plus Kiti	Qiagen	206151/206152
PCR termal döngücü	Tercihine göre.	NA
3500 Dx/3500xL Dx Genetik Analizörleri için POP-7 Polimeri	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Kapiler elektroforez sırasında kullanılan ayırma matrisi.
Saf kültür Yersinia ruckeri	NA	NA	Örneğin, kriyokonserve veya taze olarak.
RNase-içermeyen su	Qiagen	NA	İçinde: Multiplex PCR Plus Kit
Tris-borate-EDTA (TBE) tamponu	NA	NA	Standart tarif; Şirket içinde üretildi.
Tripsin soya agar/sığır kan agari	NA	NA	Standart tarif; Şirket içinde üretildi.
Vortexer	Tercihine göre.	NA

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission