Sentetik Ağız Bakteri Topluluğunu Sindirimin Simüle Edilmiş Evlerine Maruz Bırakmak

Özet

Kaynak: Arroyo, M. C. ve diğerleri. In vitro bağırsak konak-mikrob arayüzünde sentetik bakteriyel konsorsiyumunun uygulanabilirliğinin değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, simüle edilmiş ağız, mide ve bağırsak sindirimi sırasında sentetik ağız mikrobiyal topluluğunun canlılık değerlendirmesini göstermektedir. Her aşamadan sonra bakteriyel hayatta kalma miktarı ölçülür; bu da sindirim stresi nedeniyle kademeli bir azalma ortaya koyar.

Protokol

1. In vitro gastrointestinal transit koşullarından sonra bakteriyel hayatta kalma

NOT: Aşağıda açıklanan modifikasyonlarla simüle edilmiş sindirim sıvıları hazırlayın. Tüm seyreltmeleri ultra saf suyla hazırlayın. Tüm çözeltileri 0,22 μm filtreyle filtre sterilize edin ve sindirim işlemini steril koşullarda gerçekleştirin.

1. Ağız sindirimi:
   1. Bakteriyel topluluğunun 3 mL'sini 50 mL'lik steril bir tüple yerleştirin, 3 mL simüle edilmiş tükürük sıvısı (SSF) ile karıştırın; bu sıvı litrede milimol (mmol L⁻¹) içerir: Potasyum klorür (KCl), 15.1; Monopotasyum fosfat (KH₂PO₄), 3.7; Sodyum bikarbonat (NaHCO₃), 6.8; Magnezyum klorür heksahidrat (MgCl₂·6H₂O), 0.5, Amonyum karbonat [(NH₄)₂CO₃], 0.06; Hidroklorik asit (HCl), 1.1; Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl₂·2H₂O), 0.75. SSF'ye insan tükürüğünden Tip IX-A α-amilaza 75 U/mL ve domuz mideninden (Tip II) 2 g/L müsin ekleyin.
   2. Karışımı 37 °C ve 100 rpm'de 2 dakika kuluçka edin. DNA çıkarımı ve akış sitometrisi (S1) niceliği için 2 mL bir örnek alın.

2. Mide sindirimi:

1. 4 mL simüle edilmiş mide sıvısı (SGF) ekleyin; bu sıvı mmol L-1 içinde: KCl, 6.9; KH₂PO₄, 0.9; NaHCO₃, 25; Sodyum klorür (NaCl), 47.2; MgCl₂·6H₂O, 0.1, (NH₄)₂CO₃, 0.5; HCl, 15.6; CaCl₂·2H₂O, 0.075. Ayrıca, SGF domuz midesinden (Tip II) 2 g/L müsin içeriyordu.
2. pH ölçün ve gerekirse 1 mol (1 M) HCl ile pH 3'e ayarlayın. 37 °C ve 100 rpm'de kuluçka yapın. 2 mL (S2) bir örnek alın.

3. İnce bağırsak sindirimi:

1. 4 mL simüle edilmiş bağırsak sıvısı (SIF) ekleyin ve (mmol L-1 içinde): KCL, 6.8; KH₂PO₄, 0.8; NaHCO₃, 85; NaCl, 38.4; MgCl₂·6H₂O, 0.33; HCl, 8.4; CaCl₂·2H₂O, 0.3, sindirim tüpüne.
2. Gerekirse pH 7'ye ayarlayın ve 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ile kullanın. 37 °C ve 100 rpm'de kuluçka yapın. 2 mL (S3) bir örnek alın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Domuz midesinden Tip II müsin	Sigma-Aldrich	M2378
PBS	Gibco	14190250
Millipore Milli-Q akademik, ultra saf su sistemi	Millipore, Merck KGaA	-
InnOva 4080 kuluçka makinesi sarsıntısı	New Brunswick Scientific	8261-30-1007
Nükleazsız su	Serva Elektroforezi	28539010
BD Accuri C6 akış sitometresi	BD Biosciences	653118
InnuPREP PCRpure kiti	Analytik Jena	845-KS-5010250	PCR arıtma kiti