Patojenik Bakterilerle Enfekte Bitki Yaprak Dokusundan Genomik DNA Çıkarılması

Özet

Kaynak: Gulla, S. ve diğerleri. Çoklu lokus değişken sayı Tandem tekrarı Balık patojenik bakteri Yersinia ruckeri'nin Multiplex PCR ve Kapiller Elektroforez ile analizi. J. Vis. Exp. (2019).

Bu protokol, izole kolonileri ultra saf suda askıya alarak ve hücreleri lizlemek için ısı uygulayarak Yersinia ruckeri'den genomik DNA çıkarır. Santrifüjleme, DNA içeren süpernatantı hücre kalıntılarından ayırır ve PCR tabanlı genotipleme ve epidemiyolojik analiz için uygun şablon DNA elde eder.

Protokol

1. Genomik DNA'nın Bakteriyel Yetiştirilmesi ve Ekstraksiyonu

1. Uygun herhangi bir agar türüne Y. ruckeri saf kültürleri ekin (yazarlar %5 sığır kan agari kullandı) ve 22 °C'de 1-2 gün, 15 °C'de 3-4 gün kuluçka yapın.
2. Her agar plakasından, aşılama döngüsü olan tek bir temsilci koloni seçin ve 50 μL ultra saflaştırılmış su içeren 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın. Askıya alın, kısa bir girdap oluşturun ve 100 °C'de bir ısıtma bloğunda 7 dakika kuluçka yapın.
3. 16.000 x g hassasiyetinde 3 dakika santrifüj yapın ve bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice boş 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Üst DNA olarak bir sonraki adıma geçin veya o zamana kadar -20 °C'de depolayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Büyücü Genomik DNA Arındırma Kiti	Promega	A1120	Çekirdek Lizisi, RNaz, Protein Çökeltmesi ve DNA Rehidrasyon Çözeltilerinin Kaynağı
Sıvı azot	Hava Ürünleri	YOK
Mastercycler Pro ve kontrol paneli	Eppendorf	6321000019
1250 W mikrodalga	Panasonic	YOK
5424 masa üstü santrifüj	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 dijital su banyosu	Fisher bilimsel	15-462-15Q
Metal spatula	Sigma-Aldrich	Z283274
Harç ve havan	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mikser	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Steril 10 μL uçlar	TipOne	1161-3730
Steril 200 μL uçlar	TipOne	1163-1730
Steril 1250 μL uçlar	TipOne	1161-1750
Değişken Hacimli Pipetör Kiti	VWR	75788-460
Ethidium bromid	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Asetik asit	Fisher Chemical	A38-212
Tris tabanı	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvette	Eppendorf	6138000018
Biyospektrometrenin temel	Eppendorf	6135000009