Pseudomonas şıringaelerinde bakteriyosin aracılı öldürmeyi tespit etmek için yumuşak agar örtü testi

Özet

Kaynak: Hockett, K. L. ve Baltrus, D. A. Bakteriyel üretilen inhibitör bileşikleri taramak için yumuşak agar kaplama tekniğinin kullanımı. J. Vis. Exp. (2017)

Bu video, antibiyotikle indüklenen donör suşundan süpernatantın test sürünü içeren yumuşak agar kaplamasına yerleştirilerek bakteriyosin kaynaklı öldürme yöntemini göstermektedir. Kuluçka sonrası oluşan net bölgeler bakteriyel inhibisyonu gösterir.

Protokol

1. Üst Katmanların Hazırlanması ve Aktivite Için Üst Maddelerin Test Edilmesi

1. Bir P. syringae suşundan oluşan tek bir kolonini 3 ml KB (King's medium B) içine aşılayın, gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayarak inkübe yapın.
2. Ertesi sabah, kültürü 1/100 oranında taze KB'ye tekrar seyreltirin. Oda sıcaklığında çalkalayarak 3-4 saat kuluçka yapın.
3. Sterilize edilmiş su agarını, ultrasaf suya %0,35-0,7 (w/v) agar süspansiyonu otomatik olarak yerleştirerek hazırlayın.
   NOT: Yumuşak su agar stoğu mikrodalgada eritilip tekrar tekrar kullanılabilir; Her deney için yeni bir üst katman hazırlanmasına gerek yoktur. Su agarı tekrar kullanılırsa, mikrodalgada pişirmeden sonra tamamen erimesini sağlamak kritik öneme sahiptir. Eğer olmazsa, üst katman katılaştığında yorumlamayı zorlaştıracak şekilde grenli bir dokuya sahip olur.
4. Kullanımdan önce, erimiş yumuşak agari 60 °C su banyosunda saklayın. Steril serolojik pipet kullanarak, 3 ml yumuşak agar steril kültür tüpüne aktarın. Erimiş halini korumak için kültür tüpünü su banyosuna geri döndürün.
5. Üst kaplamayı dökmek için önce erimiş agarın soğumasına izin verin (sıcak hissettirmeli ama dokunulması sıcak olmamalıdır), ancak sertleşmesine izin vermeyin.
6. Steril bir başlıkta, test suş kültüründen 100 μl aşılanarak yumuşak agar ve vortekse karıştırın. Kültürü elle 10-15 saniye döndürün, ardından alt agar'a (KB agar) dökün. Plakayı her yöne eğin ki yumuşak agar, alt agari eşit şekilde kaplasın.
   NOT: Alt agar, test suşunun güçlü şekilde büyüdüğü herhangi bir katılaşmış (%1,5 agar) ortam olabilir. Standart 100 mm çapında bir Petri kabı için ~20 ml erimiş ortam kullanın. Alt agar, birkaç hafta önceden hazırlanabilir (kurutmadan 4 °C'de tutulursa) veya aynı gün hazırlanabilir.
7. Tabağı kapatın ve 20-30 dakika sertleşmesine izin verin. Plaka sertleşirken onu rahatsız etmemeye dikkat edin.
8. Sertleştikten sonra, üst katmana 2-5 μl süpernatant yerleştirin. Plakaların oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya düşmesine izin verin. Ertesi sabah sonuçları gözlemleyip kaydet.
   NOT: Süpernatantın seri seyreltilmesiyle tespit edilmesi ve uygulanması faydalı olabilir. Bu, araştırmacıların bakteriyofaj ile bakteriyosin temizleme aktivitesini ayırt etmelerini sağlayacaktır. Bu durumda, 1:5 veya 1:10 oranında seyreltme yapılması önerilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mitomisin C	Santa Cruz Biyoteknolojisi	SC-3514	Kanserojen. Uygun PPE (örneğin eldiven, göz koruma ve yüz maskesi) kullanın, özellikle stok çözeltiyi hazırlarken.
Bakteriyolojik derece agar	Genesee Scientific	20-274