Strese Uyum Sağlamış Bakterilerin Tek Koloni Seçimi Yoluyla İzolasyonu

Özet

Kaynak: Jeong, H. ve diğerleri. Kemostat kullanarak mikroorganizmaların uyarlanabilir laboratuvar evrimi prosedürü. J. Vis. Exp. (2016).

Bu video, uzun süreli stres koşullarına maruz kalan bir kültürden strese uyum sağlamış bakterilerin seçici izolasyonu ve büyümesini göstermektedir. Kültür, stresör içeren agar üzerine örtülenir ve strestör ile sıvı ortamı aşılamak için tek bir koloni seçilir. Soğukkanlılık, büyümeyi izlemek ve strese uyum sağlamış bakterilerin başarılı izolasyonu doğrulamak için düzenli aralıklarla ölçülür.

Protokol

1. Ekipman Hazırlığı

1. Bir chemostat kavanozu (150-250 ml) veya bir giriş portu ve çıkış portu içeren bir Erlenmeyer şişesi (250 ml) alın. Portları silikon boru ile bağlayarak 10-100 ml/saat akış hızları sağlanır. İsteğe göre, bir hava menfzesi, bir hava çıkış portu ve sıcaklık kontrollü su giriş ve çıkış portları kullanın.
2. Chemostat kavanozuna uygun ve çaltlama ve sıcaklık kontrolü sağlayan bir cihaz edinin (veya döner sallama kuluçka makinesi kullanın).
3. Taze ortam sağlamak ve kültürü toplamak için iki peristaltik pompa alın.
4. Orta çıkış portu ve hava giriş portu içeren bir rezervuar kavanozu (10-20 L) edinin.
5. Sulandırma hızına uygun silikon boru elde edin (örneğin, ID 0.8 mm, akış aralığı 0.06-36 ml/dakika; L/S 13 boru ile birlikte kullanıldı).

2. Orta Hazırlık ve Sterilizasyon

1. Başlangıç Ortamı
   1. 0,3 g glikoz, 0,08 g amonyum klorür (NH₄Cl), 0,05 g sodyum klorür (NaCl), 0,75 g disodyum hidrojen fosfat dihidrat (Na₂HPO₄·2H₂O) ve 0,3 g distoyun hidrojen fosfat dihidrat (KH_{2PO 4}) 90 mL damıtılmış suda (D.W.) kemostat kavanozunda çözün.
   2. Kemostat kavanozunu ve borunu kelepçelerle kapatın. Hava menfezini kapatmayın.
   3. Kemostat kavanozunu 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavda sterilize edin. Sterilizasyondan sonra kemostat kavanozunu oda sıcaklığında sakla.
   4. 0,02 g magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO₄·7H₂O), 0,01 g kalsiyum klorür (CaCl₂) ve 0,1 mg tiamin 10 mL D.W. (çözelti A) içinde çözün.
   5. Filtre çözümü A, bir şırınga ve önceden sterilize edilmiş bir şırınga filtresi (0.45 μm gözenek filtresi) kullanılarak kullanılır.
   6. Chemostat kavanozuna A çözeltisi filtratını ekleyin.
2. Stres Ortamı
   1. 30 g glukoz, 8 g NH₄Cl, 5 g NaCl, 75 g Na₂HPO₄·2H₂O, 30 g KH₂PO₄ ve 300 g disodyum suksinat heksahidrat (Na₂·suksinat·6H_2O; bu deneyde kullanılan stres adı) 9.9 L D.W. içinde bir rezervuar kavanozunda çözülür.
   2. Rezervuar kavanozunu ve borunu kelepçelerle kapatın. Hava menfezini kapatmayın.
   3. Rezervuar kavanozunu 121 °C'de 15 dakika boyunca bir otoklavda sterilize edin. Sterilizasyondan sonra kavanozu oda sıcaklığında saklayın.
   4. 2 g MgSO₄·7H₂O, 1 g CaCl₂ ve 10 mg tiamin 100 ml D.W. (çözelti A) içinde çözün.
   5. Filtre A çözümü bir şırınga ve önceden sterilize edilmiş bir şırınga filtresi (0.45 μm gözenek filtresi) ile kullanın.
   6. Rezervuar kavanozuna A çözeltisi filtratını ekleyin.
   7. Sterilize edilmiş silikon boru rezervuar kavanozuna aseptik olarak bağlayın ve peristaltik pompaları bağlayın.
3. Yüksek Gerimli Ortam
   1. Ortamı bölüm 2.2'deki gibi hazırlayın, ancak stres faktörünün daha yüksek konsantrasyonu ile (yani süksinatlı adaptasyonda 3-5 g/L daha yüksek).
      Not: Bu protokol, ortam aracılığıyla iletilebilecek bir strese uyum sağlamak içindir. Sıcaklık, hareketlenme veya aydınlatma gibi fiziksel stres faktörleri durumunda, yetiştirme buna göre tasarlanmalıdır.

3. İlk Yetiştirme

1. Tek bir vahşi tip Escherichia coli (E. coli) kolonisini, 4 ml başlangıç ortamı içeren 15 ml'lik bir test tüpünde aşılayın.
2. Test tüpünü sallama kuluçka makinesinde, 37 °C ve 220 rpm'de 12 saat boyunca inkübe yapın.
3. 1 ml prekültürü kemostat kavanozuna aseptik olarak aktarın.
4. Kemostat kavanozunu 37 °C'de 6 saat boyunca havalandırma (hava 50 ml/dakika) ve çalkalama (200 rpm) sağlayarak kuluçka edin.

4. Stres Uyumu

1. Pompalardan silikon borunun ucunu kemostat kavanozuna aseptik bağlayın.
2. Çıkış pompasını çalıştırın (10 ml/saat veya daha üzeri) ve kültür toplayın. Not: Kültür, genellikle ilk yetiştiricilikten 4-8 saat sonra üstel aşamada olmalıdır.
3. Çıkış borusundan kültürün optik yoğunluğunu (600 nm) kontrol edin.
4. Giriş pompasını çalıştırın (10 ml/saat, 0,1 saat-1 seyrelme hızına karşılık).
5. Kültürün optik yoğunluğunu çıkış borusundan 600 nm uzaklıkta her 24 saatte kontrol edin.
6. Kemostatı 96 saat (9,6 kat ciro) veya daha fazla çalıştırın. Optik yoğunluk kararlıysa, yüksek gerilimli ortamı içeren rezervuar değiştirilir. Optik yoğunluk 0.2'den düşükse, besleme giriş pompasını 6 saat durdurun. Giriş pompasını yeniden başlatın ve optik yoğunluğun 0.2'nin üzerinde olduğundan emin olun.
7. Daha yüksek stresör konsantrasyonu içeren bir rezervuara geçerek stres faktörünün konsantrasyonunu kademeli olarak artırın.
8. Uyarlanmış kültür bir dönüm noktasına ulaştığında (örneğin, 100 g/L süksinat stresine adapte olmuş bir suş) alın ve daha fazla genomik analiz için saklanın.
9. Numune depolamak için, kültür örneğini (0,5 ml) sterilize edilmiş %80 gliserol çözeltisi (0,5 ml) ile karıştırın ve -80 °C'de saklayın. Not: Mikroorganizma ALE işlemi sırasında stres faktörünü bozma yeteneği kazanırsa, fermantasyon kavanozundaki stres konsantrasyonu taze rezervuardaki konsantrasyonla aynı değildir.

5. Strese Uyum Sağlamış Suşun Tek Koloni İzolasyonu

1. Aynı strestör içeren ve aynı konsantrasyonda bir agarlı ortam (%1,6 agar) hazırla.
2. Chemostat'tan çıkan çıkış kültürünü (0,1 ml) levha ile 37 °C'de 16 saat kuluçka yapın.
3. Plakadan tek kolonileri steril bir kürdanla seçin ve bunları kemostattaki aynı stres faktörü ve aynı orta konsantrasyonda içeren 15 ml test tüplerinde aşılayın ve 6 saat kuluçka yapın.
4. 1 ml kültür suyu 50 ml ortam içeren 250 ml Erlenmeyer şişesine aktarın. Her 1 saatte 0,5 ml kültür suyu alın ve aşırı dozu 600 nm'de ölçün. Uyarlanmış suşun büyüme oranını, stres faktörü göz önüne alındığında vahşi tip suşla karşılaştırın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mini-kemostat fermentörü	Biotron Inc.	-	özel siparişle üretilmiştir
Silikon boru	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	Boru boyutu, seyreltme oranına ve fermentör kavanozunun boyutuna bağlı olarak değiştirilebilir.
Rezervuar kavanozu	Bellco	Medya depolama şişesi	20 L
Kimyasal	Sigma-Aldrich	-	Reaktif derecesi
Glikoz	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reaktifi
NH₄Cl	Sigma-Aldrich	A9434	moleküler biyoloji için, hücre kültürüne uygun olanlar, %99,5 ≥
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reaktifi, %≥99%
Na₂HPO₄·2H₂O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	795488	ACS reaktifi, %≥99%
MgSO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reaktifi, ≥98%
CaCl₂	Sigma-Aldrich	793639	ACS reaktifi, ≥96%
Tiamin·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	Reaktif derecesi, ≥99%
Na₂succinate·6H₂O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, %99 ≥