1. Mikrobiyal izolasyon için su ve mercan toplama ve depolama
NOT: Örnekleme alanlarının koordinatlarını ve sıcaklıklarını almak çok önemlidir. Mümkünse, tuzluluk, pH, derinlik ve ışık yoğunluğu gibi meta veriler, ince ayarlanmış yetiştirme yaklaşımlarının bulunmasında ve verilerin gelecekteki yorumlanmasında da yardımcı olabilir. Güvenilir sonuçlar için örnekleri mümkün olan en az süre boyunca saklayın. Su/mercan mikrobiyomları, örnekler doğru sıcaklıkta tutulmazsa ve/veya uzun süre saklanırsa önemli ölçüde değişebilir. İzolasyon adımı toplandıktan hemen sonra yapılmazsa, örneklerin işleme başlanana kadar 4 °C'de tutulması çok önemlidir. Örnekler ne kadar uzun süre saklanırsa, hatta 4 °C'de bile, mikrobiyal topluluk o kadar çok değişir.
- Deniz suyunu örnekleyin ve saklayın.
- Her hedeflenen örnekleme alanından en az üç adet 500 mL su örneği toplayın. Tercihen vidalı kapaklı steril şişeler kullanın.
- Suyu toplandıktan hemen sonra işliyorsanız, şişeleri kısa bir süre RT rejiminde tutun. Numune işleme daha sonra yapılacaksa, şişeleri 4 °C'de tutun.
- Mercanı örnekleyin ve saklayın.
- Su örneklerinin aynı örnekleme alanından mercan parçalarını kesmek için steril bir pense kullanın. Kontaminasyondan kaçınmak için mercanlara sadece steril eldivenlerle dokunun.
- Örneklenen mercan parçasını 20 mL steril tuzlu çözelti (damıtılmış suda %3 NaCl) veya yapay deniz suyu ile durulayarak deniz suyunun gevşek yapışmış serbest yaşayan bakterilerini giderin.
- Forseps kullanarak, her mercan parçasını steril 250−500 mL'lik steril bir kapta steril tuzlu su çözeltisi içeren vida kapağına yerleştirin.
- Laboratuvarda, steril forseps ve pense kullanılarak, 5 g mercan parçalarını tartı üzerinde steril 100 mm x 20 mm Petri kapları ile tartılır.
- 5 gram mercan örneğini steril bir harva aktarın ve steril bir havanla maserasyonla maserasyonla pişirin.
- Steril bir spatula kullanarak, maserlenmiş örneği %3 NaCl steril çözelti ve 5 mm ölçüsünde 10−15 cam boncuk içeren steril bir kültür şişesine aktarın. Harcı yıkamak ve maseratın maksimum miktarını geri kazanmak için 45 mL steril salin çözeltisi kullanın.
- Flasonları, örnekleme alanının su sıcaklığında 16 saat boyunca sürekli çalkalama (150 x g) altında tutun.
NOT: Sığ su mercanları için optimal sıcaklık 24−28 °C arasında değişir. Bu adım, konak hücrelere bağlı olan veya doku ile iskelet içinde yaşayan mikroorganizmaları farklı mercan bölmelerinden ayırır. Bu adımdan sonra mercan maseratları saklanmamalı ve izolasyon adımı anında yapılmalıdır.
2. Sentetik östrojen 17a-etinilmestradiol (EE2) bozucu bakterilerin deniz suyu ve/veya mercanlardan izolyasyonu
- Bakterileri seçin.
NOT: 1.1.2 ve 1.2.7. adımlardan sonra, deniz suyunda farklı mercan maseratlarından ayrılmış mikroorganizmaların konsantrasyonu bilinmemiş ve değişken olacaktır. Petri kaplarında agar ortamı içeren bireysel mikrobiyal kolonilerin izolasyonunu garanti etmek için seri seyreltmeler gereklidir.- Mercan örnekleri için steril tuzlu çözeltide 10-9 dereceye kadar, su örnekleri için ise 10-6 kadar seri seyreltme yapılabilir. Pipet seyreltmelerini 5 kez yukarı aşağı seyreltin ve sonra ucu atın. Vortex her zaman 5 saniye örnek aldıktan sonra bir sonraki seri seyreltme işlemi yapılır.
- Her seyreltmeden 100 μL pipit yaparak %3 NaCl lizojeni suyu (LB) agar ortamı içeren Petri kablarında ve tabakla.
NOT: Alternatif bir ortam olarak deniz agari (MA) kullanın. Güvenilir sonuçlar için her seyreltmeden üçlü katlar gereklidir. - Plakaları hedef sıcaklıkta (örneğin 26 °C) 1−3 gün kuluçka edin. Plakaları günde bir kontrol et.
- Yeni plakalarda belirgin büyüme morfolojileri sunan kolonileri çizgi plaka tekniği ile seçip izole et. Bu adımı plakalarda saf koloniler büyümesi için gerekli sayıda tekrarlayın.
- Eğer işlem anında 2.3.1. adıma devam edilmezse, izolatları 4 °C'de veya bölüm 2.2'de tarif edildiği gibi gliserol içinde depolayın.
- Gliserol stokları hazırlayın.
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve uzun vadeli bakteriyel stokların depolanması için kullanılabilir.- Taze plakadan veya 4 °C'de depolanan plakalardan tek koloniler seçin ve bunları 2 mL steril LB ortamında bağımsız olarak aşılayın.
- Tüpleri gece boyunca 24−28 °C'de sürekli çalkalama (150 x g) altına alın.
- 2.2.2. adımdan bakteri kültürlerinden 1 mL ve steril gliserol eklenerek 2 ml kriyoviallere %20 konsantrasyon elde edilir.
- Kryovialleri 4 °C'de açık bırakın.
- Gliserol bakteri stoklarını ihtiyaç duyulana kadar -80 °C olarak koyun.
- EE2-bozulma yetenek testini yapın.
- İzolatları LB suyu veya alternatif ortamda aktive edin. Bunun için, taze plakalardan veya 4 °C'de depolanan plakadan tek bir koloni seçin ve 2 mL steril LB ortamı aşılayın. Eğer gliserol stoku ise, önce LB agar plakalarına çizin ve 24−28 °C ON'da kuluçka yapın, böylece tek koloni büyüyebilir. LB ortamını içeren tüpü sürekli çalkalama (150 x g) altında 24−28 °C ON'da eğimli hale getirin.
- Bakteri büyümesinden sonra, hücreleri 8.000 x g sıcaklığında oda sıcaklığında (RT) 8 dakika boyunca santrifüjlenerek pellet yapın. Üst suyu atın ve hücreleri nazikçe yukarı aşağı pipetleyerek hücreleri eşit hacimde (2 mL) tuzlu suyla yeniden süzülerek kalan LB çorbasını yıkayın.
- Karbon kaynağı izi kalmamasını sağlamak için 2.3.2 adımını iki kez tekrarlayın ve hücreleri eşit hacimde tuzlu çözelti içinde yeniden süzülür. Örneğin, 2 mL kültürle başlatıldıysa, hücreler son hacmde 2 mL tuzlu çözelti olarak yeniden süzülür.
- Yıkanmış ve yeniden süzülmüş hücreleri, tek karbon kaynağı olarak EE2 içeren minimum Bushnell Haas kültür ortamında (BH Suyu) aşılayın.
NOT: EE2, kültür ortamında son konsantrasyon 5 mg/L olan etanolde çözülür. Gerekirse kirletici türü ve/veya konsantrasyonda değişiklikler yapın. - 600 nm optik yoğunlukta ve/veya LB agar ortamında koloni oluşumu birimleri (CFU) ile 16−72 saat kuluçka için bakteriyel büyümeyi değerlendirin.
NOT: Alternatif olarak, mikroorganizmalar EE2 veya diğer bileşiklerin tek karbon kaynağı olarak bulunduğu minimum ortamda doğrudan izole edilebilir. Bu adım, seçimi yönlendirir ve istenmeyen büyümeyi önler.