Deniz Suyu Örneklerinden Petrol Bozucu Deniz Bakterilerinin Seçici Zenginleştirmesi ve İzolasyonu

Özet

Kaynak: Villela, H. D. M . ve diğerleri. Metaorganizma Araştırması ve Koruma için Biyoremediasyon ve Probiyotik Geliştirme için Mikrobiyal Suşların Araştırılması. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, petrol bazlı ortamda deniz suyu örneklerinin zenginleştirilmesiyle petrol bozucu deniz bakterilerinin seçici izolasyonunu gösteriyor; bu da ham petrol biyoremediasyonu ve çevresel temizlikte potansiyel uygulamalara sahip saf suşların geri kazanılmasını sağlıyor.

Protokol

1. Mikrobiyal izolasyon için su ve mercan toplama ve depolama

NOT: Örnekleme alanlarının koordinatlarını ve sıcaklıklarını almak çok önemlidir. Mümkünse, tuzluluk, pH, derinlik ve ışık yoğunluğu gibi meta veriler, ince ayarlanmış yetiştirme yaklaşımlarının bulunmasında ve verilerin gelecekteki yorumlanmasında da yardımcı olabilir. Güvenilir sonuçlar için örnekleri mümkün olan en az süre boyunca saklayın. Su/mercan mikrobiyomları, örnekler doğru sıcaklıkta tutulmazsa ve/veya uzun süre saklanırsa önemli ölçüde değişebilir. İzolasyon adımı toplandıktan hemen sonra yapılmazsa, örneklerin işleme başlanana kadar 4 °C'de tutulması çok önemlidir. Örnekler ne kadar uzun süre saklanırsa, hatta 4 °C'de bile, mikrobiyal topluluk o kadar çok değişir.

1. Deniz suyunu örnekleyin ve saklayın.
   1. Her hedeflenen örnekleme alanından en az üç adet 500 mL su örneği toplayın. Tercihen vidalı kapaklı steril şişeler kullanın.
   2. Suyu topladıktan hemen sonra işliyorsanız, şişeleri kısa bir süre RT (oda sıcaklığında) tutun. Numune işleme daha sonra yapılacaksa, şişeleri 4 °C'de tutun.
2. Mercanı örnekleyin ve saklayın.
   1. Su örnekleriyle aynı örnekleme alanından mercan parçalarını kesmek için steril bir pense kullanın. Kontaminasyondan kaçınmak için mercanlara sadece steril eldivenlerle dokunun.
   2. Örneklenen mercan parçasını 20 mL steril tuzlu çözelti (damıtılmış suda %3 NaCl (sodyum klorür) içinde) veya yapay deniz suyu ile durulayarak deniz suyunun gevşek yapışmış serbest yaşayan bakterilerini yok edin.
   3. Forseps kullanarak, her mercan parçasını steril 250−500 mL'lik steril bir kapta steril tuzlu su çözeltisi içeren vida kapağına yerleştirin.
   4. Laboratuvarda, steril forseps ve pense kullanılarak, 5 g mercan parçalarını tartı üzerinde steril 100 mm x 20 mm Petri kapları ile tartılır.
   5. 5 gram mercan örneğini steril bir harva aktarın ve steril bir havanla maserasyonla maserasyonla pişirin.
   6. Steril bir spatula kullanarak, maserlenmiş örneği %3 NaCl steril çözelti ve 5 mm ölçüsünde 10−15 cam boncuk içeren steril bir kültür şişesine aktarın. Harcı yıkamak ve maseratın maksimum miktarını geri kazanmak için 45 mL steril salin çözeltisi kullanın.
   7. Flasonları, örnekleme alanının su sıcaklığında 16 saat boyunca sürekli çalkalama (150 x g) altında tutun.
      NOT: Sığ su mercanları için optimal sıcaklık 24−28 °C arasında değişir. Bu adım, konak hücrelere bağlı olan veya doku ile iskelet içinde yaşayan mikroorganizmaları farklı mercan bölmelerinden ayırır. Bu adımdan sonra mercan maseratları saklanmamalı ve izolasyon adımı anında yapılmalıdır.

2. Yağ bozucu bakterilerin deniz suyu ve/veya mercanlardan izole edilmesi

1. Tek karbon kaynağı olarak yağda çözünemeyen fraksiyon (oWSF) ve yağda suda çözünmeyen fraksiyon (oWIF) içeren minimum bir ortam hazırlayın.
   1. 500 mL steril damıtılmış suya %1−2 ham yağ ekleyin. Çözünmeyen fraksiyonun üst tabakasını bozmadan çözünürken alt kısmı açık bir filtre şişesi kullanın.
   2. Karışımı 24−28 °C'de 150 x g sıcaklıkta 48 saat boyunca sürekli çalkalama altında tutun.
   3. Ham yağ fraksiyonlarını içeren filtre şişesini stabil bir yüzeye yerleştirin ve çözünen ve çözünmeyen fraksiyon ayrımı için 10−20 dakika bekleyin.
   4. OWSF'yi yeni steril bir şişeye aktarın, alt filtre şişesini açıp çözünür fraksiyonu çıkararak oWIF'i kurtarın.
   5. Önceki adımda elde edilen tüm oWSF (~400 mL) kullanılarak, oWSF'nin tek karbon kaynağı olarak bulunduğu 1 L BH (Bushnell Haas) minimum agar ortamı hazırlanır.
   6. 2.1.4. adımdan itibaren şişede kalan oWIF'i kullanarak, oWIF'in tek karbon kaynağı olduğu minimum BH agar ortamı 1 L hazırlanır.
2. oWSF ve oWIF'i bozan bakterileri izole edin.
   1. Sırasıyla 1.1.2 ve 1.2.7. adımlardan su ve mercan maseratı kullanılarak, aşağıdaki gibi steril tuzlu çözeltide örnekleri ^10-6'ya kadar seyreltirin.
3. Mercan örnekleri için steril tuzlu çözeltide ^10-9 dereceye kadar, su örnekleri için ise ^10-6 kadar seri seyreltme yapılabilir. Pipet seyreltmelerini 5 kez yukarı aşağı seyreltin ve sonra ucu atın. Vortex her zaman 5 saniye örnek aldıktan sonra bir sonraki seri seyreltme işlemi yapılır.
4. Her seyreltmeden 100 μL pipot yapın, BH-oWSF ve BH-oWIF agar ortamı içeren Petri kabına ve bunları tabaklayın.
5. Plakaları hedef sıcaklıkta (örneğin 26 °C) 1−3 gün kuluçka edin. Plakaları günde bir kontrol et.
6. Yeni plakalarda belirgin büyüme morfolojileri sunan kolonileri çizgi plaka tekniği ile seçip izole et. Bu adımı plakalarda saf koloniler büyümesi için gerekli sayıda tekrarlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
500 mL PYREX Medya Depolama Şişesi	Thomas Scientific/Corning	1743E20/1395-500	Su örneklemek için kullanılır.
500 mL aspiratör şişeleri	Thomas Scientific/Corning	1234B28/1220-2X	Yağ fraksiyonlarını ayırmak için kullanılır.
6 inçlik tel kesici pençesi	Thomas scientific/Restek	1173Y64/23033	Mercan parçalarını kesmek için kullanılır.
Agar	Himedia	PCT0901-1KG	Sağlam medya yapmak için kullanıldı.
Bushnell Haas Buloru	Himedia	M350-500G	Karbon kaynaklarıyla desteklenen minimum medya olarak kullanılmıştır.
Erlenmeyer Matarası	Thomas Scientific/DWK Yaşam Bilimleri (Kimble)	4882H35/26500-125	Cam boncuklarla mercan maceratını kuluçkalamak için kullanılır.
Laminar Akış Başlığı			Steril koşullarda çalışmam gerekiyordu.
Luria Bertani Suyu, Miller (Miller Luria Bertani Sözü)	Himedia	M1245-1KG	Bakteri yetiştirmek için zengin ortam olarak kullanılır.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar)	Himedia	M384-500G	Bakteri yetiştirmek için zengin ortam olarak kullanılır.
Yörünge-Sarsıcı Kuluçka Makinesi			Sıvı ortam ve yağın kuluçka içinde.
Plaka Kuluçka Makinesi			Plakaları kuluçka altına almak için kullanılır.
Porselen Harç ve Havan	Thomas scientific/United Scientific Supplies	1201U69/JMD150	Mercan parçalarını parçalamak için kullanılır.
Soğutmalı Santrifüj			Bakteriyel kültürleri santrifüj etmek için kullanılır.
Spektrofotometre			Bakteriyel kültürlerin optik yoğunluğunu ölçmek için kullanılır.
Büyücü Genomik DNA Arındırma Kiti	Promega	A1120	Mikrobiyal suşların DNA çıkarımı için kullanılır.