Mikrofluidik bir sistemde tek hücre çözünürlüğünde bakteri büyümesini takip etmek

Özet

Kaynak: Cabeen, M. T. ve diğerleri. Bacillus subtilis'in Tek Hücreli Mikrofluidik Analizi. J. Vis. Exp. (2018)

Video, tek hücre düzeyinde bakteri büyümesini gözlemlemek için mikrofluidik bir cihazın kullanıldığını gösteriyor. Mikro ölçekli hendeklerde hapsedilmiş hareketsiz bakteriyel hücrelerin sürekli olarak floresan mikroskobu altında nasıl görüntülendiğini ve beslendiğini gösteriyor. Bu kurulum, hücre bölünmesi ve soy takibinin birden fazla nesil boyunca gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar.

Protokol

1. PDMS Cihaz Dökümü

1. Tozsuz bir ortamda, Polidimetilsiloksan (PDMS) polimeri ve kürleme maddesini 10:1 oranında karıştırın ve en az 10 dakika vakum altında gaz yapın.
2. Bir silikon master (veya onun epoksi veya poliüretan replikasi) polistiren Petri plakasında kırık olmayan alüminyum folyo parçasına yerleştirin. Gazlı PDMS karışımını ana gövdeye yaklaşık 5 mm derinliğe döküm. Petri plakasını en az 10 dakika boyunca gazdan çıkarın. Yüzey kabarcıklarını kırmak için hafif bir hava akışı kullanın.
   NOT: Plastik bir replika master gazdan çıkarma sırasında kısmen yüzebilir; Böyle bir durum olursa, replikayı temiz plastik aplikatör ile aşağı itin.
3. PDMS'i fırında 60 °C'de en az 1 saat kürleyin ve oda sıcaklığına soğutun. Petri plakasından ana ve kürlenmiş PDMS içeren alüminyum folyoyu çıkarın. Master'ın arkasındaki alüminyum folyoyu dikkatlice soyun, ardından ana bilgisayardan PDMS'yi dikkatlice çıkarın.
   NOT: Alternatif olarak, PDMS gece boyunca oda sıcaklığında kürlenebilir. Silikon-wafer master'ın göreceli kırılganlığı, waferin aynı boyutta 1/16 inç kalınlığında bir alüminyum diske kalıcı olarak bağlanması için epoksi yapıştırıcı kullanılarak aşılabilir.
4. Bir wafer genellikle biraz farklı boyutlara sahip birkaç mikrofluidik cihaz içerdiğinden, tek bir cihazı temiz ve keskin bir bistüre kullanarak boyutuna göre kesin.
   NOT: Rutin Bacillus subtilis çalışmaları için, 1.0 μm genişliğinde hücre hendekleri olan cihazlar kullanın.

2. Cihaz Yumması ve Bağlanması

1. Desenli özelliklerin görünürlüğünü artırmak için cihazın desenli tarafına bir parça saydam ofis bandı (bkz. Malzemeler Tablosu) yerleştirin. Giriş ve çıkış portları, görünür akışkan kanallarının zıt uçlarında dairesel alanlar olarak tanımlanmıştır (Şekil 1). Cihazda giriş ve çıkış pinleri için delik açarken görünürlüğünü artırmak için, giriş ve çıkışları ince uçlu bir işaretleyiciyle noktalarla işaretleyin.
   NOT: Giriş ve çıkış pinlerinin kalabalık olmamasını sağlamak için, cihazın alfabetik belirticisinin hemen altındaki kanaldan başlayarak diğer tüm kanallar deliklenir.
2. PDMS cihazını desenli tarafı aşağıya atacak şekilde çevirin ve cihazı işaretli noktalara 0,75 mm biyopsi deliği ile delikle geçirin; Delikleri at.
   NOT: Cihazlar, desenli tarafı aşağı deliklenir çünkü biyopsi deliği tarafından oluşturulan delik genellikle yumruk polimere girdiği yerde hafifçe genişleşir. Cihazı ters bir konumda deliklemek, desenli taraftaki deliğin keskin bir kenar olmasını sağlar.
3. Stereomikroskop kullanarak, delikli deliklerin cihazın giriş ve çıkış alanlarıyla örtüşmesini sağlayın. Delikli deliklerden gereksiz PDMS parçalarını çıkarmak için ince uçlu cımbızlar kullanın.
4. Cihazın her iki tarafındaki tozu temizlemek için yapışkan bant kullanın ve temiz polistiren Petri plakasına yerleştirin. %100 izopropil alkolle ıslatarak ve temiz oda mendiliyle ovalayarak 22 mm x 40 mm ölçülerinde bir örtülü cam hazırlayın; tozsuz hava veya azot akışıyla kurutulmuştur.
5. Delikli PDMS cihaz özelliğini, temizlenmiş kapak camıyla birlikte yan tarafı üst pozisyonda oksijen plazma temizleyicisine yerleştirin.
   1. Cihazı şu ayarlarla plazma ile işledin: vakum, 70 mTorr; O₂ basıncı, 200 mTorr; süresi 15 sani; Güç, 30 W. Plazma işlem süresi biter bitmez, cihazı çıkarın ve plazma temizleyicisinden camı kapatın.
   2. PDMS'yi ters çevirin ve desenli tarafın camla temas edecek şekilde kapak camının ortasına yerleştirin; Giriş ve çıkış alanları arasındaki besleme kanallarının kap camının uzun ekseniyle hizalı olduğundan emin olun. PDMS'nin cama karşı sıkışmasını sağlamak için çok nazikçe bastırın.
6. Monte edilen cihazı fırında en az 1 saat 60 °C'de pişirin. Fırından sonra, cihazın bir köşesine hafifçe basarak PDMS'nin cama bağlandığını manuel olarak doğrulayın.
   NOT: Cihaz bağlandıktan sonra, plazma tedavisinden sonra polimer giderek daha hidrofobik hale geldiği için 24 saat içinde kullanılmalıdır.

3. Mikrofluidik Tesisat Hazırlığı

1. Polimer boru uzunluklarını (iç çapı (ID) 0,02 inç, dış çapı (OD) 0,06 inç) şırınga pompasından anahtarlama cihazına (kullanılıyorsa) ve mikroskopa monte edildiğinde cihaza ulaşacak şekilde uygun uzunluklara kesin. Mikrofluidik şeritler olduğu kadar uzun kes.
2. Sıxma valfleri için Y bağlantılarını (kullanıyorlarsa) birleştirin; 2 cm uzunluklarda esnek silikon boru (0,03 inç ID, 0,065 inç OD) "Y"nin üst dikenlerine ve 1 cm silikon boru uzunluğunu "Y"nin alt dikenine kesip takabilirsiniz.
3. 10 cm (veya uygun) polimer boru uzunluklarında kesin; Bunları bir ucundan anahtar birleşimine bağlayarak "Y"nin alt dikenindeki 1 cm'lik silikon boru segmentlerine yerleştirin." Diğer uçta, plastik şırınga adaptörlerinden çıkarılan ve iğne ucundan yaklaşık 90° yaklaşık 9 mm bükülmüş 21G iğnelere bağlayın.
4. 21G küt iğneleri, şırıngalardan anahtar cihazına kadar uzanan boru segmentlerinin bir ucuna iğneleri tüpelere yerleştirerek bağlayın. Her boru uzunluğunun diğer uçlarını Y bağlantılarının giriş dikenlerindeki silikon boru segmentlerine yerleştirin.
   NOT: Sıkma valflerini ve bağlantılarını yerinde tutmak için bir tür cihaz kullanın; bu kolayca mikropipet uç kutusundan yapılabilir (Şekil 2D).
5. Atıkları cihazın çıkışından atık beakerine taşımak için polimer boru uzunluklarını kesin. Bir uçta, yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmış bükülmüş 21-G iğnelere bağlayın. Tüplerin diğer ucunu atık beakerine bantlayın.
6. 0.1 mg/mL sığır serum albümini (BSA) içeren uygun hacimlerde malzeme hazırlayın ve istenen boyut ve sayıda şırınga doldurun. BSA yüklü şırıngaları giriş borusuna bağlı hazırlanmış 21G iğnelere bağlayın ve şırıngaları şırınga pompalarına yükleyin.
   NOT: Tipik deneyler için, cihazın 5 kanalı kullanılır ve her biri 20 mL'lik bir şırınga ile kullanılır. Ortamın değiştirildiği bir deney, her biri 5 şırıngadan oluşan 2 banka gerektirir. Burada, birinci bankayı içeren pompa faz 1 pompası, ikinci bankayı içeren pompa ise anahtar sonrası ortamla birlikte faz 2 pompası olarak adlandırılır.
7. Enşiringe pompalarını yüksek akış hızında (>500 μL/dakika) çalıştırarak giriş tesisatından havayı arındırın; önce şırınga pompalarını dikey olarak yönlendirip şırıngaları vurarak hava kabarcıklarını yukarıya çıkarabilirsiniz. Şırıngalardan hava temizlendikten sonra, şırınga pompasını yatay olarak yerleştirin ve şırıngalardan gelen polimer hatlarını anahtar cihazından kademeli olarak yukarı doğru tıklayarak hava kabarcıklarını çıkarıp temizleyin. Bu işlemi ikinci şırınga bankası için (eğer medya değiştiriyorsanız) tekrarlayın.
8. Hava kabarcıkları temizlendikten sonra, faz 2 şırınga pompasını (yani, anahtardan sonra ikinci kullanılacak ortamla) 1,5 μL/dakika olarak ayarlayın, ardından akışı durdurun. İkinci orta faza karşılık gelen Y bağlantılarının dalındaki esnek boru segmentlerine küçük bağlayıcı klipsler yerleştirin. Faz 1 şırınga pompasını en az 30 dakika boyunca mütevazı bir akış hızında (örneğin, 10 μL/dakika) çalıştırmaya devam edin; böylece Y kavşağının aşağısındaki giriş borusundan ikinci ortamı temizleyin.

4. Hücre Kültürü Hazırlığı

1. İstenen ortamda ilgi gören suşun bir ön kültürünü bir gece boyunca sabit aşamaya kadar yetiştirin. Bakteri suş, hücrelerin cihazın kanallarından dışarı yüzmemesi için hücreleri hareketsiz hale getiren bir mutasyon içermelidir.
   NOT: Bu protokolde bakteriyel suş B. subtilis 3610'dur ve bir hagA233V ikamesi içerir (bu mutasyon flagellumun helikal yerine düz olmasına neden olur ve hücre hareketliliğini engeller), hücre stresi için PrsbV-mNeonGreen raporlayıcısı ve hücreleri vurgulamak için bir yapısal Phyperspank-mNeptun (kırmızı) raporlayıcı içerir. Örnek protokolde Luria-Bertani (LB) Lennox ortamı kullanılmıştır. Mikrofluidik deneyler için tipik suşlar, hücrelerin otomatik olarak tespit edilmesini kolaylaştırmak için bir veya daha fazla floresan transkripsiyon raporlayıcı ve bileşen olarak üretilen bir sitoplazmik floresan protein içerir. LB Lennox zengin ortam kullanıldığında büyüme kusurları gözlemlenmemiştir, ancak minimal ortamda B. subtilis büyümesi, mikrofluidik koşullarda engellenebilir çünkü salgılanan sideroforlar ortam akışı tarafından yıkanır. Bu koşullarda, S750 ortamında bildirildiği gibi, ortama sodyum sitrat ve ferrik klorür eklenerek büyüme yeniden sağlanabilir.
2. Deneyin sabahı, B. subtilis hücrelerini 1:50 hassasiyetinde 250 mL büyüme ortamı içeren şaşkın bir şişeye çevirin. Hücreleri 37 °C'de sallanma kültüründe 5 - 6 saat boyunca optik yoğunluk 1'den büyük bir şekilde büyütülür.
   NOT: Yoğun bir hücre kültürü tercih edilir çünkü sabit faz B. subtilis hücreleri daha küçük ve hücre zincirlerinde daha az bulunur, bu da cihaz yüklenmesini kolaylaştırır. Farklı bakteri türleri optimal yükleme için başka ortam veya büyüme koşullarına ihtiyaç duyabilir.
3. 5 μm gözenek boyutunda bir filtreyle donatılmış bir şırınga kullanılarak, yaklaşık 15 mL hücre kültürünü 15 mL'lik konik bir tüpe filtreleyerek B. subtilis hücre zincirlerini çıkarabilir ( E. coli için gereksizdir ve diğer türlerde gerekli olmayabilir).
   NOT: Görece az hücre çıkarılmalıdır; Filtrat bulanık olmalı.
4. Filtrelenmiş kültürü oda sıcaklığında 4.000 x g ile 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı boşaltın ve hücre pelletini tüpte kalan süpernatant sıvıya yeniden süsküyerek, gerekirse hücre süspansiyonunun pipetlenmesini kolaylaştırmak için yaklaşık 500 μL taze ortam ekleyin.

5. Cihaz Yüklemesi

1. Boş ince jel yüklemeli mikropipet uçlarını (bkz. Malzemeler Tablosu) mikrofluidik cihazın çıkış deliklerine nazikçe yerleştirin.
2. İnce jel yükleme uçları ve P200 mikropipeti kullanılarak, cihazı giriş deliklerine 1 mg/mL BSA içeren ortam enjekte ederek pasifize eder, çıkış deliklerindeki uçları gözlemleyerek mikrofluidik kanalların dolmasını izler (Şekil 2A). Cihazı oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika kuluçka edin.
   NOT: BSA yaygın olarak PDMS polimerinin hidrofobik yüzeyine bağlanan, hidrofilikini artıran ve diğer proteinlerin veya hücrelerin (hücre yüzeyi molekülleri aracılığıyla) bağlanmasını azaltan bloklama veya pasivasyon ajanı olarak kullanılır.
3. İnce jel yükleme uçları kullanılarak, her kanalı yeniden askıya alınmış hücrelerle (Bölüm 4'ten) yükleyin; çıkış kanalındaki uçlar kullanılarak hücrelerin cihazdaki ilerleyişini izleyebilir (Şekil 2B).
   NOT: Yükleme, P200 mikropipetini maksimum 200-μL hacmine ayarlanarak ve ardından küçük bir hacmi (pipet ucunun ince kısmının yaklaşık yarısı hacmin) aspirasyon yapılmadan önce bir hava yastığı aspirasyonu ile kolaylaştırılır. Yeniden askıya alınmış hücrelerin hacmi kesin olmak zorunda değildir, çünkü PDMS cihazının hacmi mikropipetin hacmine göre küçüktür. Hücre askı cihazına pipet edilebildiği sürece, yeniden askıya alınan hücrelerin yoğunluğuna bir üst sınır biliyoruz. Hücre kümeleri cihazı tıkayabilir ve kapsamlı pipetleme ve/veya girdap karıştırmasıyla önlenmesi gerekir.
4. Jel yükleme uçlarını çıkış deliklerinden nazikçe çıkarın, cihazın zarar görmesini önlemek için tek tek çalışın.
5. Cihazı, uygun bir rotor adaptöründe yaklaşık 6.000 x g renkte 10 dakika boyunca tezgah üstü mikrosantrifüjde santrifüj yapın (Şekil 2C).
   NOT: Mikrosantrifüj rotoruna sığacak şekilde tasarlanmış özel olarak işlenmiş alüminyum rotorlu adaptör (Şekil 2C) kullanıldı; Farklı santrifüj modelleri uygun rotor adaptörleriyle kullanılabilir. Adaptörün önemli özelliği, hücre çukurlarının kapalı uçlarına doğru yan kuvvet sağlaması ve böylece hücreleri yan kanallara zorlamasıdır.
6. Mikroskop altında başarılı yüklemeyi doğrulayın (Şekil 3), ancak cihazı sürgü tutucusuna/sahne yerleştirmesine takmadan.
   NOT: Bu protokolde, hem bu aşamada doğrulama hem de sonraki görüntüleme için 60X, 1.4 NA Ph3 yağ daldırma hedefi kullanılır.

6. Cihaz Montajı, Dengeleme ve Montaj

1. Yüklü cihazı, PDMS'nin her iki yanındaki kapak camını sahne girişinin altına bantlayarak dikkatlice bir sahne girişine monte edin (yani cihaz takmadan önce sahne girişini ters çevirin). Aşama yerleştirme cihazı montajını PDMS'nin yukarıya bakacak şekilde ters çevirin ve tozsuz bir silecek gibi yumuşak bir yüzeye yerleştirin (Şekil 2D).
2. Faz 1 şırınga pompasının akış hızını 35 μL/dakika olarak ayarlayın. Bir şeritle bir şeritle çalışırken, giriş iğnesini ve ardından çıkış iğnesini (yani atık beaker'e doğru koşmak; Şekil 2E).
3. Fazla ortamı temiz, tozsuz bir mendil ile silin ve cihazı sızıntı açısından görsel olarak inceleyin. Çıkış borusunu fazla hücrelerin (genellikle bulanık bir şerit olarak görünen) ve yavaş yavaş atık beaker'e doğru ilerleyen orta menisküs görünümü için inceleyin.
4. Cihazın yaklaşık 15 - 30 dakika boyunca 35 μL/dakika ile çalışmasına izin verin, ta ki tüm bağlı hatlar atık beakerine boşalana kadar.
5. Faz 1 şırınga pompasını 1,5 μL/da'ya ayarlayın ve akışı durdurun. Tüm pompa ve cihaz cihazını mikroskopa götürün (bu işlem, hepsini bir tekerlekli arabaya yerleştirerek desteklenir) ve faz 1 ortam akışını 1,5 μL/dakika ile yeniden başlatın. Cihazla birlikte sahne girişini dikkatlice ters floresan mikroskopuna monte edin, giriş ve çıkış borusunu yönlendirmek için gerektiğinde bant kullanın.
6. Cihazda görüntüleme için istenen pozisyonları bulun ve istenen şekilde görüntülemeye başlayın. Hücrelerin genellikle sabit durumlu üstel faz büyümesine ulaşmak için birkaç saat (yaklaşık 10 nesil) gerektirdiğini ve görüntü alımının başlangıcının istendikçe gecikmeli olabileceğini ve görüntülemenin dengelenme döneminden sonra başlaması için görüntü alımı gecikmeli olabileceğini unutmayın.
   NOT: Üstel fazda tutulan hücrelerin sabit durum büyümesi, hücre bölünme süreleri takip edilerek ve sabit minimum değere ulaştıklarından emin olarak sonraki görüntü analizinde doğrulanmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1: Mikrofluidik cihazın şeması. Bir cihaz şeması yaklaşık olarak ölçekli gösterilir. Alfabetik belirtiji, kör uçlu iğneleri bağlamak için deliklenen giriş ve çıkış bölgeleriyle birlikte etiketlenir. Genellikle, desenli kanalların yarı...

Malzemeler