$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bakteriyel kültür koşulları
- Laminar akış başlığı altında, yeşil floresan protein (GFP) etiketli Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, -80 °C'de depolanan) gliserol stokundan 100 μL gliserol stoku kullanılarak 5 mL Luria-Bertani (LB) ortamı aşılanacaktır. Gece boyunca 250 rpm'de sallanırken 30 °C'de kuluçka yapın.
- Ertesi gün, gece boyunca kullanılan kültürün 100 μL'sini 5 mL LB ortamında yeniden askıya alın ve aynı koşullarda 5 saat boyunca kuluçka (üstel faz) kullanın. 1 mL aliquot'u 2 mL'lik bir tüpe örnekleyin, oda sıcaklığında (~15 dakika) soğumaya izin verin ve santrifüjle (2300 x g 5 dakika) yapın.
- Süpernatantı çıkarın ve pellete 1 mL hareketlilik tamponu ekleyin. Numuneyi homojenleştirmek için kısa bir girdap tutuyor. İstenilen hücre konsantrasyonuna ulaşmak için seyreltirin, örneğin, 5 x 105 mL-1.
- Doğal toplulukları içeren deneylerde, örneğin akarsulardan türetilenler için, seçici olmayan bir yetiştirme ortamı hazırlanır. Örneğin, steril filtrelenmiş ve otoklavlanmış akarsu suyu veya karmaşık bir karbon kaynağı (LB ortamı) ile değiştirilmiş yapay bir akarsu suyu ortamı kullanın.
2. Polidimetilsiloksanda (PDMS) mikrofluidik cihazın hazırlanması
- İstenen gözenekli geometriyi, bilgisayar destekli çizim (CAD) yazılımı ile tasarlayın; bu yazılım, bir daire matrisinden (yani akışa karşı geçirimsiz engel) oluşur ve yarıçaplı boyut ve merkez koordinatlarıyla tanımlanır.
NOT: Rastgele taner ve gözenek boyutlarına sahip gözenekli bir geometriye örnek Şekil 1A'da verilmiştir. Çıkışa yakın engelsiz bir gözlem kanalı, kırılma eğrilerinin (BTC) edinilmesini kolaylaştırır. - Seçilen geometriye göre, standart SU-8 fotolitografisi kullanarak bir kalıp hazırlanır.
NOT: Alternatif olarak, kalıplar özel bir mikrofabrika tesisinden de sipariş edilebilir. Yatay düzlemde heterojen akış elde etmek için, mikrofluidik odasının kalınlığını ortalama gözenek boğazı büyüklüğüyle aynı büyüklükte tasarlamak önemlidir. Ancak, mikrofluidik cihazın boyutlarının mikroskop altında gözlem için uygun olduğundan emin olun (örneğin, mikroskop slaytları üzerinde çalışma). - 50 g PDMS, iğnesiz bir şırınga kullanarak %90 ağırlığında elastomerin %90'ına çapraz bağlayıcı (dimetil, metilhidrojen siloksan kopolimeri) ekleyerek hazırlayın. Temiz koşullarda çalışın ve mümkün olduğunca tozdan kaçının. İki reaktifi temiz, tek kullanımlık bir kapta karıştırın ve 30 dakika boyunca vakum (100 mbar) uygulayarak viskoz PDMS'den çözünmüş hava ve kabarcıkları temizleyin.
- Kalıpı bir Petri kabına yerleştirin (çapı 100 mm, yüksekliği 15 mm). PDMS'yi kalıbın üzerine istenen yüksekliğe (örneğin 2-5 mm) dök. Petri kabını kapatın ve 60 °C'de 4 saat boyunca (kalın katmanlar için gece boyunca) tutun ve kürlenmesi için.
NOT: Görselleştirme amaçları için, ışık PDMS'den geçebilmelidir; bu nedenle, 2 mm ila 5 mm arasında ince bir tabaka tercih edilir. Daha kalın katmanlar (>5 mm) cihazın şeffaflığını azaltırken, daha ince katmanlar uygulama sırasında deformasyonlara maruz kalır. - Küfü fırından çıkarın ve mikrofluidik cihazın oda sıcaklığına soğumasına izin verin. Soğuduktan sonra, PDMS'nin istenen kısmını bir bistüriyle dikkatlice çıkarın.
NOT: Kalıp üzerindeki güçlü baskılar kalıp çatlaklarına yol açar. PDMS'ye çıplak ellerinizle dokunmayın, çünkü parmak izleri optik şeffaflığı etkiler. - İstenilen geometrinin kazındığı PDMS kanalının altını geçici olarak bantla mühürleyin. 0,5 mm çapında bir biyopsi deliciyle, mikrofluidik kanalı delerek 0,5 mm (iç çaplı) boruya uygun bir giriş ve çıkış oluşturulur.
NOT: PDMS'nin yumuşak yapısı, boru yerleştirildiğinde sıkılığı sağlar. PDMS cama sızdırmandıktan sonra giriş ve çıkış kanalları yapılamaz. - Mikrofluidik kanalı, yüksek frekanslı jeneratör (plazma bağlayıcısı, Materyaller Tablosu) kullanılarak oksijen plazma bağlanmasıyla mühürleyin. Bunun için, 25 mm x 75 mm ölçümdeki bir silikat cam sürgü etanolle temizleyin ve kurumasına izin verin. Bandı PDMS kanalından çıkarın ve kanalı gözenekli tarafı yukarıya bakacak şekilde yerleştirin. Silikat cam slaytı ve PDMS yüzeylerini oda sıcaklığında yaklaşık 45 saniye plazma ile işleyin.
- PDMS kanalını silikat cam sürgüye yerleştirin ve sıcak plakada 100 °C'de 30 dakika ısıtın.
- Mikrofluidik cihazı sıcak plakadan çıkarıp oda sıcaklığına soğutun. PDMS kanal girişini borulara bağlayın. PDMS'den havayı çıkarmak için 30 dakika vakum uygulayın; bu hava sıvılara neredeyse geçirimsiz ama gaz için geçirimlidir.
- 100 mL hareketlilik tamponu (10 mM potasyum fosfat, 0.1 mM etilenidiamintetraasetik asit (EDTA), %1 w/v glikoz, pH 7.0 takviyesi) hazırlayın ve 10 μL min-1 ile çalışan bir şırınga pompası ile mikrofluidik cihaza 1 mL enjekte edin.
NOT: PDMS gazda az doygun olduğundan (önceki vakum adımı nedeniyle), baloncuklar ~30 dakika içinde kaybolur.
3. PDMS mikrofluidik cihazları kullanarak bakteri taşınımını analiz etmek
- Hareketlilik tamponu ile önceden doymuş PDMS mikrofluidik cihazını mikroskop aşamasına yerleştirin. Aşama hareketi sırasında akışı en aza indirmek için boru sabitlemek için bant kullanın.
- Mikroskop aşamasını çıkışa yakın gözlem kanalına taşıyın. Parlak alan mikroskobu veya faz kontrastı kullanarak, gözlem kanalının merkezine odaklanın ve büyütmeyi bireysel bakteri hücrelerini görselleştirecek şekilde ayarlayın.
- Işık yolu ayarlarını floresan mikroskopisine geçirin ve kamera pozlama süresini bireysel bakteri hücrelerini çözecek şekilde ayarlayın (örneğin, 100 ms) veya hücrelerin floresan sinyalleri arka plan gürültüsünden en az 3 kat daha güçlü olsun.
- Sonra, giriş borusunu bakteriyel süspansiyonu içeren 2 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Pompa yönünü tersine çevirin ve süspansiyonu 1 μL min-1 akış hızıyla çekmeye başlayın.
- Tüm gözlem kanalının kesitini tara, her 2 dakikada bir bileşik görüntü kaydederek, deney boyunca tamamının.
