İndüklenebilir bir gen ifade sisteminin bakteriyel efektör proteini ifade eden hücrelere aktarılması

Özet

Kaynak: Berens, C. ve diğerleri. Bakteriyel virülans faktörlerinin hücre içi sinyal ile girişimini incelemek için indüklenebilir bir ifade sistemi uygulamak. J. Vis. Exp. (2015)

Bu video, bakteriyel efektör protein CaeB'nin konak apoptotik kaskadını nerede bozduğunu belirlemek için indüklenebilir bir ekspresyon sisteminin kullanımını göstermektedir. Tetrasiklin-tepkili bir sistemle CaeB-eksprese eden hücrelerin transfekte edilmesi, pro-apoptotik gen ekspresyonunu indüke etmek ve zincir içindeki bozulma noktasını belirlemek için adımları özetler.

Protokol

1. Kararlı Hücre Hattının İndüksiyon İfade Vektör Sistemi ile Transfeksiyonu

1. Tohum, insan embriyonik böbreği (HEK)293 hücreleri, 12 kuyu ölçüsünde 12 kuyu içinde yeşil floresan protein (GFP) veya GFP-CaeB'yi istikrarlı şekilde ifade eder.
2. Tohumlamadan 19 saat sonra, hücreler regülatör plazmid ve yanıt plazidi ile birlikte transfekte edilir; ya Bax kodlanır ya da aktive kaspaz 3 kullanılır.
   1. Stabil HEK293 hücrelerini 100 ng pWHE125-P regülatör plazmidi (Şekil 1) ve 100 ng yanıt plazmidleri pWHE655-hBax veya pWHE655-revCasp3 (Şekil 2) ile birlikte transfekte eder ve 0,4 μl polietilenin içerir.
   2. Deoksiribonüklein asit (DNA) ve polietilenimin transfeksiyon reaktifini 75 μl Opti-MEM ortamında hazırlayın ve oda sıcaklığında tam 5 dakika kuluçka yapın. Kompleks oluşumu için, her iki karışımı RT'de birlikte 15 dakika boyunca inkübe edin.
3. Polietilemin/DNA çözeltisini hücrelere damla olarak ekleyin ve %5_CO2 içinde 37 °C'de kuluçka yapın.

2. Apoptozun İndükasyonu

1. Transfeksiyondan 5 saat sonra, kültür ortamına 1 μg/ml dokksisiklin eklenerek pro-apoptotik proteinlerin ekspresyonunu tetikler. Hücreleri %5_CO2 içinde 37 °C'de 18 saat kuluçka edin.

Sonuçlar

Şekil 1. Düzenleyici plazmid pWHE125'in şematik genel bakışı. Bakterilerde yayılma için gerekli elementler; örneğin çoğaltmanın kaynağı (ori pBR) ve ampisilin (Amp R) karşı antibiyotik direnç kaseti (Amp^R) ile Tet-transregul...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM	Yaşam teknolojileri	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pen/Streprep	Yaşam teknolojileri	15140-122
OptiMEM	Yaşam teknolojileri	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Polietilen Amin	Polisyenler	23966
Doksisiklin	Sigma Aldrich	D9891