Bakterilerde Biyolojik Gürültünün Zaman Geçişli Mikroskopi Kullanılarak Sürekli İzlenmesi

Özet

Kaynak: Chaimovitz, E. A. ve diğerleri. Escherichia coli'de biyolojik gürültünün zaman geçişli mikroskopiyle sürekli ölçümü. J. Vis. Exp. (2021)

Bu video, bakteriyel büyüme ve bölünme sırasında GFP floresansındaki dalgalanmaları zaman geçişli mikroskopi kullanarak E. coli'de biyolojik gürültünün gerçek zamanlı görselleştirilmesini göstermektedir.

Protokol

1. Mikroskopi görüntüleme için numunenin hazırlanması
   1. Su banyosundan matayı çıkarın. Mataşa dışını temiz ve oda sıcaklığına (25 °C) kadar soğumasına izin verin.
      NOT: Zamanlayıcı bitmeden yaklaşık 3 dakika önce matayı çıkarın.
   2. Sürekli olarak 3 mL jel levha çevresine dairesel bir hareketle dökün. Birkaç dakika sertleşmeye bırakın.
   3. Plakaları bantla kapatın ve 25 G iğneyle birkaç delik delin. Su yoğuşmasının jele damlamasını önlemek için tüm tabakları çevirin.
   4. Tüm yemekleri 4 °C'de 30 dakika kuluçka altına alın, böylece tam katılaşma sağlanır ve hücre mitozunu önleyebilirsiniz.
      NOT: Numuneleri ardışık ölçümler için 4 °C'de bırakın, en fazla bir gün olmamalıdır.
   5. Mikroskobu üreticinin talimatlarına göre başlatın.
   6. En düşük amplifikasyonlu lensi kullanarak ilk odaklamayı bulun ve otomatik odak sistemini (AFS) devreye sok.
   7. Gerekirse yağ kullanın, lensi yağla boğun ve plakayı platform kontrolcüsüyle (manuel değil) hareket ettirerek dikkatlice yayabilirsiniz, böylece AFS tekrar devreye girebilir.
   8. Z aşamalı kesitler için varsayılan öneriye uygun olarak, göreceli kesit Z yönünde kullanın.
      NOT: Her 5 dakikada bir parlak alan görüntüleri ve her 20 dakikada bir floresan görüntüler alın. Bazen odak ilk 30 dakika içinde ayarlanması gerekir. Mikroskop kuluçka kutusunu ve yağı önceden ısıtır, numuneyi buzdolabında tutarken ilk odak kaybını azaltmaya yardımcı olur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
35mm cam çanak	Mattek	P35G-0.170-14-C	Kalınlık mikroskop lensine karşılık gelir.
Agarose	Lonza	5004	LB hazırlığı
Tutulma Ti	Nikon		Ters mikroskop
Immersol 518F	Zeiss	4449600000000	Daldırma yağı
Parafilm bant	Bemis	PM-996	Metinde bant olarak adlandırılır