Genetik olarak Değiştirilmiş Bakteri Hücrelerinde Hedef Enzim İfadesinin Tespiti

Özet

Kaynak: Kim, H. ve ark., Yüksek verimli Genetik Enzim Tarama Sistemi Kullanarak Çok Enzimli Tarama. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, metagenomik fosmid kütüphaneleri ve kromojenik substratlar kullanılarak enzim ifadesini tespit etmek için genetik tarama yöntemini göstermektedir. Akış sitometrisi, renkli ürünler üreten tek hücreleri tanımlar ve izole eder; böylece aktif enzim eksprese eden hücrelerin yüksek verimlilikte seçimini sağlar.

Protokol

1. Metagenomik Kütüphanen'in p-nitrofenol (pNP) (pNP-GESS) tespiti için genetik enzim tarama sistemi ile hazırlanması
   1. Fosmid kütüphanesi üretim kiti kullanarak fosmid vektörlü bir Escherichia coli'de metagenomik bir kütüphane oluşturmak.
   2. −70 °C'de depolama için kütüphanenin 100 μl aldığı Aliquot, metagenomik kütüphane hücrelerinin kaynağıdır.
      NOT: Bu kütüphane stokunun 600 nm dalga boyunda ölçüldükleri bir örnekin optik yoğunluğu yaklaşık 100'dür.
   3. Stok metagenomik kütüphanesinden 100 μl buzun üzerinde eritip 500 ml Luria-Bertani (LB) ve 12,5 μg/ml kloramfenikol içeren 500 ml'lik bir şişede aşılayın, ardından 2 saat boyunca 37 °C kuluçka uygulanır.
   4. Hücreleri, 1.000 x g sıcaklığında 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yaparak 50 ml'lik konik bir tüpte hasat edin.
   5. Pelleti hızla 50 ml buz soğukluğu damıtılmış suya (DW) geri alın ve 1.000 x g ile 20 dakika boyunca tekrar 4 °C'de santrifüj yapın.
   6. Pelleti %10 (v/v) gliserol ile 50 μl buz gibi soğuk DW ile yeniden askıya alın. Elektroporasyon için bu hücre aliquotundan 50 μl kullanın.
   7. 50 μl elektro yetkili hücreler ve pGESS(E135K) DNA (100ng) karışımını buz gibi bir elektroporasyon küvetine yerleştirin ve karışımı elektroporat (1.8 kV/cm, 25 μF) içine yerleştirin.
   8. Hızla 1 ml süper optimal suyu katabolit baskılama (SOC) ortamıyla ekleyin ve hücreleri nazikçe tekrar süzültün.
   9. Hücreleri pipet kullanarak 14 ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın ve 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
   10. Kurtarılan hücrelerin 500 μl'sini, 12,5 μg/ml kloramfenikol ve 50 μg/ml ampisilin içeren LB 20 x 20 cm kare bir plakaya yayımlayın. Plakayı 30 °C'de 12 saat kuluçka edin.
   11. Kolonileri bir hücre kazıyıcı ile kazıyın ve hücreleri buz soğukluğu hücre depolama ortamı kullanarak 50 ml'lik konik bir tüpte toplayın.
   12. 1.000 x g ile 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Pelleti 10 ml buz soğuk hücre depolama ortamında tekrar süslü olarak askıya alın ve OD₆₀₀ 100'e ulaşın.
   13. −70 °C'de depolama için hücrelerin 20 μl almasını sağlar.
        
2. Metagenomik Kütüphane'den Yanlış Pozitiflerin Kaldırılması
   1. Metagenomik DNA fosmid ve pGESS(E135K) içeren stok metagenomik kütüphane hücrelerini (Step 1.13'ten) buz üzerinde eritin.
   2. Hücrelerin 10 μl'sini, 50 μg/ml ampisilin ve 12,5 μg/ml kloramfenikol içeren 2 ml LB içinde 14 ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüpte aşılayın. 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak 4 saat kuluçka yapın.
   3. Bu arada, floresansla aktiflenen hücre sorter (FACS) makinesini açın ve varsayılan FACS yazılımını açın. Aşağıdaki ayarları kullanın: nozul ucu çapı, 70 μm; İleri Saçılma Alanı (FSC-A) hassasiyeti, 300 V-logaritmik amplifikasyon; Yan Saçılma Alanı (SSC-A) hassasiyeti, 350 V-logaritmik amplifikasyon; floressein izotiosiyanat alan (FITC-A) hassasiyeti, 450 V-logaritmik amplifikasyon; eşik parametresi, FSC-A değeri 5.
      NOT: Malzeme Tablosu'nda belirtilen FACS cihazı için tipik ayarlar verilmiştir. Diğer FACS cihazlarının ayarlarını ayarlayın.
   4. Metagenomik kütüphane hücrelerini, 1 ml fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) içeren 5 ml yuvarlak tabanlı bir tüpe 5 μl numune ekleyerek seyreltirin.
   5. Sulandırılmış kütüphane örneğini FACS cihazının yükleme portuna yerleştirin ve FACS yazılımının Edinim Paneli'nde Yükle butonuna tıklayın.
   6. Olay hızını, kontrol panelindeki Flow Rate butonlarına tıklayıp kontrol ederek saniyede 1.000 - 1.500 olaya ayarlayın.
   7. Araç çubuğundaki Dot Plot butonuna tıklayarak küresel bir çalışma sayfasında log ölçekli FSC-A ile log ölçekli SSC-A dağılma grafiki oluşturun. Araç çubuğundaki Polygon Gate butonu ile R1 saçılım kapısını singlet olaylarını (bakteri popülasyonu) kapsayacak şekilde ayarlayın.
   8. Histogram butonuna tıklayarak hücre sayısı ile log ölçekli FITC-A ile histogramı çizin. Sonra, Inspector Control penceresindeki Sitometre Ayarları sekmesinden FITC voltajını çan şeklindeki dağılımın zirvesini^{FITC-A'nın 10,2'sinden} az olacak şekilde ayarlayın.
   9. Log ölçekli bir FSC-A ile karşılaştırma oluşturun. FITC-A günlük çizimini küresel çalışma sayfasındaki Nokta Grafiki butonuna tıklayarak gerçekleştirebilirsiniz. Araç çubuğundaki Polygon Gate düğmesini kullanarak grafikte bir sıralama kapısı R2 ayarlayın; böylece kapı dağılımın merkezinden +%5 ile -5% hücreler arasında (çan şeklindeki eğrinin zirvesinde toplam %10 hücre) konumlandırılır.
   10. FACS cihazının çıkışına 50 μg/ml ampisilin ve 12.5 μg/ml kloramfenikol içeren 1,2 ml LB içeren bir toplama tüpünü yerleştirin ve hem R1 hem de R2 kapılarını sağlayan 10⁶ hücreyi ayıklayın.
   11. Toplama tüpünü, kapağı çıkarın ve nazikçe girdabı çıkarın.
        
3. Metagenomik Enzim Taraması
   1. Sıralanan hücreleri (Adım 2.11'den itibaren) 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak OD₆₀₀ 0.5'e ulaşana kadar kuluçka edin.
   2. Hücre içi fosmid kopya sayısını artırmak için 1 μl kopya indüksiyon çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 °C'de ek 3 saat kuluçka ile 250 rpm'de sallayın.
   3. Hücreleri ayırmaya hazırlamak için, kültürlenmiş hücrelerden 0,5 ml ve uygun bir substrat (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-sellobiosid veya fenil fosfat) 14 ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüpte 100 μM nihai konsantrasyonda eklenin.
      1. Kontrol örneği için, 3.2. Adımdan alınan kültürlenmiş hücrelerden 0,5 ml 14 ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe ekleyin. Adım 3.3'teki substrat hacmiyle aynı PBS hacmini ekleyin.
   4. İki örneği 37 °C'de 200 rpm'de 3 saat boyunca çalkalayarak inkübe edin.
   5. Bu arada, FACS makinesini Step 2.3'teki konfigürasyonlarla hazırlayın.
   6. Sırayla 5 μl hücre eklenir ve kontrol hücreleri sırasıyla 1 ml PBS içeren iki 5 ml yuvarlak tabanlı tüplere yerleştirilir.
   7. Kontrol hücrelerini içeren tüpü FACS'in yükleme portuna yerleştirin ve FACS yazılımının Acquisition Dashboard'da Load butonuna tıklayın. Olay Hızını kontrol panelindeki Flow Rate butonları kontrol ederek saniyede 1.000 - 3.000 olaya ayarlayın.
   8. Yazılımın küresel çalışma sayfasındaki Nokta Grafiki butonuna tıklayarak log ölçekli FSC-A ile log-ölçekli SSC-A dağılma grafiki oluşturun ve araç çubuğundaki Polygon Gate butonu kullanarak saçılım kapısı R1'i singlet olaylarını (bakteri popülasyonu) kapsayacak şekilde ayarlayın.
   9. Çalışma sayfasındaki Nokta Grafiki düğmesine tıklayarak log ölçekli FSC-A ile log ölçekli FITC-A dağılma grafiki oluşturun ve araç çubuğundaki Polygon Gate butonu ile grafikte R2 sıralama kapısı ayarlayın; böylece R2 kapısında negatif hücrelerin %0,1'inden azı algılansın.
   10. Kontrol örnek tüpünü sıralama örnek tüpü ile değiştirin ve gösterge panelindeki Flow Rate butonları kontrol ederek olay hızını saniyede 1.000 - 3.000 olay olarak ayarlayın.
   11. FACS cihazının çıkışına 0,5 ml LB içeren bir toplama tüpü yerleştirin ve hem R1 hem de R2 kapılarını karşılayan 10⁴ hücreyi ayırın.
       NOT: Sıralama kriteri, R2 kapısındaki FITC-A'nın en üst %0,1'inden %5'ine kadar değişebilir. Bu protokolde, hücrelerin en üst %1'i pozitif olarak toplandı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CopyControl	Merkez üssü	CCFOS110	Fosmid kütüphanesi üretim kiti
CopyControl indüksiyon çözümü	Merkez üssü	CCIS125	Fosmid kopya indüksiyon çözümü
EPI300	Merkez üssü	EC300110	Elektrokompetetli hücre
pCC1FOS	Merkez üssü	CCFOS110	Fosmid vektörü
Gen pulseri Mxcell	Bio-Rad		Elektroporasyon küveti ve elektroporat sistemi
FACSAria III	Becton Dickinson		Akış Sitometrisi (FACS makinesi)
AZ100M	Nikon		Mikroskop
Ultraslim	Maestrogen		LED aydınlatma cihazı
50 ml'lik konik tüp	BD Falcon
14 ml yuvarlak tabanlı tüp	BD Falcon
5 ml'lik yuvarlak tabanlı tüp	BD Falcon
p-nitrofenil fosfat	Sigma-Aldrich	N7653	Substrat
p-nitrofenil β-D-sellobiosid	Sigma-Aldrich	N5759	Substrat
p-nitrofenil bütilat	Sigma-Aldrich	N9876	Substrat
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Tripton 10 g/L, maya ekstraktı 5 g/L, sodyum klorür 10 g/L
Süper optimal et suyu (SOB)	BD Difco	244310	Tripton 20 g/L, maya ekstraktı 5 g/L, sodyum klorür 0,5 g/L, magnezyum sülfat 2,4 g/L, potasyum klorür 186 mg/L
Katabolit baskısı (SOC) ile süper optimal et suyu		SIKTIR, %0.4 glikoz
2x maya ekstraktı tripton (2xYT)	BD Difco	244020	Kazeinin pankreas sindirimi 16 g/L, maya öztü 10 g/L, maya öztü 5 g/L
Hücre depolama medyası			2x YT çorbası, %15 gliserol, %2 glikoz
pGESS(E135K)			dmpR, egfp genleri ve uygun promotörleri, RBS ve terminatör içeren bir DNA vektörüdür. Daha fazla detay için el yazmasındaki referans 5'e bakınız.
Kloramfenikol	Sigma	C0378
Ampisilin	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Flow Cytometry Software Sürüm 7.0
PBS	Gibco	70011-044	%0,8 NaCl, %0,02 KCl, %0,0144 disodyum fosfat, %0,024 monopotasyum fosfat, pH 7,4