In Vitro İnsan bağırsak mikrobiyotası ile kolonik fermantasyonu taklit etmek için parti kültürü modeli

Özet

Kaynak: Ahmadi, S. ve diğerleri. Girişimsel rejimlerin insan dışkı mikrobiyotası üzerindeki etkilerini tahmin etmek için in vitro toplu kültür modeli. J. Vis. Exp. (2019).

Bu video, bağırsak mikrobiyotasının metabolit üretimini incelemek için anaerobik koşullarda diyetle fermente edilebilir lifle fekal örnekleri inkübe yoluyla bağırsak mikrobiyal fermantasyonunu modelleme yöntemini göstermektedir.

Protokol

Örnek toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

DİKKAT: Uygun Malzeme Güvenlik Veri Formlarına bakın ve uygun Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) eğitimi için talimatlar ve yönergeleri takip edin. Standart biyogüvenlik kurallarına uygun tüm kültür adımlarını takip edin ve aseptik koşullarda BSL-2 kabini kullanın. Ayrıca, farklı modellerden ve insan deneden alınan dışkı örnekleri, mikrobiyal kaynaklı hastalıkların yayılma riski taşıyabilir. Herhangi bir yaralanma veya enfeksiyon durumunda derhal tıbbi yardım al. Ayrıca, insan ve hayvan dışkısı örneklerinin kullanımı kurumsal etik komiteler tarafından onaylanmalı ve örnekler ile konu bilgilerinin kullanımı protokollerine uygun olmalıdır.

1. Kültür Medyasının Hazırlanması

1. Kültür ortamının hazırlanması, dokuz tür stok çözeltisi hazırlanır:
   1. Çözelti A (1.000 mL): 5,4 g sodyum klorür (NaCl), 2,7 g potasyum dihidrojen fosfat (KH₂PO₄), 0,16 g kalsiyum klorür dihidrat (CaCl₂·2H₂O), 0,12 g magnezyum klorür heksahidrat (MgCl₂·6H₂O), 0,06 g manganez klorür tetrahidrat (MnCl₂·4H₂O) çözün, Deionize suda 0,06 g kobaltoz klorür heksahidrat (CoCl₂·6H₂O) ve 5,4 g amonyum sülfat (NH₄)2SO₄, toplam hacmi 1.000 mL'ye çıkarır.
   2. Çözelti B (1.000 mL): 2,7 g Potasyum Hidrojen Fosfat (K₂HPO₄) deiyonize suda çözünerek toplam hacmi 1000 mL'ye çıkarır.
   3. İz mineral çözeltisi (1.000 mL): 500 mg disodyum etilendiamin-tetraasetat dihidrat (Na₂EDTA), 200 mg demir sülfat heptahidrat (FeSO₄·7H₂O), 10 mg çinko sülfat heptahidrat (ZnSO₄·7H₂O), 3 mg manganez(II) klorür tetrahidrat (MnCl₂·4H₂O), 30 mg fosforik asit (H₃PO₄) çözün, Deionize suda 20 mg CoCl₂·6H_2O, 1 mg cuprik klorür dihidrat (CuCl₂·2H₂O), 2 mg nikel(II) klorür heksahidrat (NiCl₂·6H₂O) ve 3 mg sodyum molibdat dihidrat (Na₂MoO₄·2H₂O) deionize suda toplam hacmi 1.000 mL'ye ulaştırmak için kullanılır.
      NOT: Bu çözelti ışığa hassastır, bu yüzden koyu/siyah veya alüminyum sarılmış tüplerde/şişelerde saklanmayı unutmayın.
   4. Suda çözünür vitamin çözeltisi (1.000 mL): Deionize suda 100 mg tiamin hidroklorürit (Tiamin-HCl), 100 mg D-pantotenik asit, 100 mg Niasin, 100 mg piridoksin, 5 mg P-aminobenzoik asit ve 0,25 mg B12 vitamini deiyonize suda çözünerek toplam hacmi 1.000 mL'ye ulaşır.
   5. Folat: biotin çözeltisi (1.000 mL): 10 mg folik asit, 2 mg D-biotin ve 100 mg amonyum bikarbonat (NH₄HCO₃) deionize suda çözünerek toplam hacmi 1.000 mL'ye çıkarır.
   6. Riboflavin çözeltisi (1.000 mL): 10 mg Riboflavin 5 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-etansülfonik asit) (1,19 g/L) çözeltisinde çözünerek toplam hacmi 1.000 mL'ye çıkarır.
   7. Hemin çözeltisi (10 mL): 5.000 mg Hemin'i 10 mM sodyum hidroksit (NaOH) (0,4 g/L) çözeltisinde çözünerek toplam hacmi 10 mL'ye çıkarır.
   8. Kısa zincirli yağ asidi karışımı (10 mL): 2,5 mL N-valerat, 2,5 mL izovalerat, 2,5 mL izobutirat ve 2,5 mL: DL-α-metilbutirat birleştirin.
      NOT: Bu çözüm, koku ve buharı önlemek için buharlı bir kaptan kullanılması önerilir.
   9. Resazurin (1.000 mL): 1 g resazurin deionize suda çözün ve toplam hacmi 1.000 mL'ye çıkar.
2. In vitro anaerobik fermantasyon için kullanılan ortam
   1. Bu ortamı hazırlamak için 330 mL A çözeltisi, 330 mL Çözelti B, 10 mL İz mineral çözeltisi, 20 mL suda çözüneýän vitamin çözeltisi, 5 mL folat: biotin çözeltisi, 5 mL Riboflavin çözeltisi karıştırın; 2,5 mL Hemin çözeltisi, 0,4 mL Kısa zincirli yağ asidi karışımı, 1 mL Resazurin, 0,5 g maya özdüsü, 4 g sodyum karbonat (Na₂CO₃), 0,5 g Sistein HCl-H₂O ve 0,5 g Triptikaz ile 296,1 mL damıtılmış su eklenir.
   2. pH değerini kontrol edin ve yaklaşık 7.0 olduğundan emin olun; Yoksa pH 1 N HCl veya 1 N NaOH ile ayarlayın. Aseptik iş istasyonunun altındaki şişe filtresiyle ortamı vakum filtreleyerek sterilize edin.
   3. Alternatif olarak, tüm bileşenleri (vitamin ve hemin çözeltileri hariç) karıştırın ve 121 °C'de 20 dakika otoklav yapın ve oda sıcaklığına soğumasına izin verin. Aynı zamanda, vitamin ve hemin çözeltilerini 0,22 μm membran filtreleriyle filtre ile sterilize edin ve bunları dağıtmadan önce otoklavlanmış ve soğutulan ortama ekleyin.

2. Anaerobik Odanın Hazırlanması ve Gerekli Malzemeler

1. Fermantasyon deneyi için gereken tüm malzemeler, çözelti ve aletleri deneyin başlamasından en az 48 saat önce anaerobik odada bulundurun; böylece aletlerle ilişkili kalıntı oksijen ve çözünür oksijen tamponlar/çözelti sistemlerde alınır ve tüm malzemeler belirlenen anaerobik koşullara alışır.
   NOT: Anaerobik odada ihtiyaç duyulan malzemeler (deneyin başlaması için 48 saat önce): (i) fermantasyon ortamı; (ii) anaerobik çözelti (bölüm 4.1'e göre hazırlanır), (iii) vortekser, (iv) tartı dengesi, (v) muslin tuş bezleri, (vi) makas, (vii) huni, (viii) 1.5, 2.0, 15, 50 mL tüpler, (ix) pipetör (2, 20, 200 ve 1.000 μL) ve uyumlu pipet uçları, (x) tabanca pipeti ve pipetler (5 ve 10 mL), (xi) kağıt dokular, (xii) işaretleyiciler, (xiii) farklı tüpler için tüp ayakları, (xiv) atık kutusu, (xv) O2 göstergesi ve (xvi) %70 etanol sprey şişesi (dezenfektan).

3. Tüplerin ve liflerin hazırlanması

1. 300 mg inulin tartı ve 50 mL'lik bir tüpe aktarılır, ardından anaerobik odada önceden hazırlanmış ve saklanan 26 mL fermantasyon ortamı aseptik eklenir. Her dışkı örneği tipi ve deneysel tüp(ler) için (test edilen bileşik sayısına göre) üçlü olarak bir boş tüp hazırlayın.
2. Bu tüpleri anaerobik odada yaklaşık 24 saat bırakarak fermantasyon deneyine başlamadan önce örneklerin nemlendirilmesine izin verin. Aşılama sırasında tüp sıcaklığının 37 °C olduğundan emin olun, bu nedenle tüpleri anaerobik odanın içinde kapalı kuluçka makinesine getirin.

4. Aşı Hazırlığı

1. Anaerobik seyreltme çözeltisi (fermantasyon deneyinden en az 48 saat önce): 5 g NaCl, 2 g glukoz ve 0,3 g Sistein-HCl deiyonize suda çözünür ve toplam hacmi 1.000 mL'ye çıkarır. Otoklav yapın ve kullanımdan en az 48 saat önce anaerobik odada saklayın.
2. Dışkı aşısı hazırlama (fermantasyon deneyi gününde): 5 g taze dışkı örneğini 50 mL'lik konik bir tüpte tart, son hacmi 50 mL (1:10 w/v) için anaerobik seyreltme çözeltisi ekleyin ve tamamen homojenleşene kadar 15 dakika girdabla bekletin. Homojenize karışımı 4 katman steril tülbez (otoklavlanmış) üzerinden filtreleyin ve hemen ilaç içeren tüplerde aşı için kullanın.
   NOT: Deneysel amaç, belirli bir bileşiğin/bileşenin genel sağlıklı ve hasta dışkı mikrobiyotası üzerindeki etkisini karşılaştırmak ise, bir grup denek dışkısından alınan dışkı örnekleri birleştirilebilir.

5. Fermantasyon ve Örnekleme

1. Tüpleri bölüm 4.2'ye göre hazırlayın ve boşluk/kontrol ile deneysel tüpleri 4 mL seyreltilmiş ve filtrelenmiş dışkı inokulumuyla aşılayın. Aşılanan tüpleri anaerobik odada 37 °C sıcaklıkta inkübe edin. Lifleri ve aşıyı yeniden askıya almak için tüpleri her saatte bir nazikçe ters çevirerek sallayın.
2. Örneğin, fermantasyon sırasında her saat 0, 3, 6, 9 ve 24 saat aralarında 2 mL aliquot örneği alınarak ilgili fermentasyon tüplerinden 2 mL'lik bir tüpe alınarak örnekleri gerektiği kadar sık toplayın.
3. Laboratuvar pH ölçeri kullanarak aliquotların pH ölçümü (pH elektrotunu doğrudan numuneye yerleştirerek); Kalan örneği 14.000 x g ile 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Hemen süpernatant ve peleti sıvı azotta dondurun, ardından süpernatantı SCFA (kısa zincirli yağ asitleri) analizi için ve peleti mikrobiyom analizi için -80 °C'de depolayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amonyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	217255
Amonyum sülfat	TGI	C2388	Zehirli
Kalsiyum klorür dihidrat	Sigma-Aldrich	C3306	Can sıkıcı
Kobaltoz klorür heksahidrat	Sigma-Aldrich	255599
Kuporik klorür dihidrat	Acros organikleri	2063450000	Zehirli, sinir bozucu
Sistein-HCl	Sigma-Aldrich	C121800
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4501
D-Pantotenik asit	Alfa Aesar	A16609
Disodiyum etilendiamintetraasetat dihidrat	Biorad	1610729
DL-α-metilbütirat	Sigma-Aldrich	W271918
Demir sülfat heptahidrat	Sigma-Aldrich	F8263	Zehirli
Folik asit	Alfa Aesar	J62937
Glikoz	Sigma-Aldrich	G8270
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039
Hepes	Alfa Aesar	A14777
İzobütirat	Alfa Aesar	L04038
İzovalerat	Alfa Aesar	A18642
Magnezyum klorür heksahidrat	Sigma-Aldrich	M8266
Manganez klorür tetrahidrat	Sigma-Aldrich	221279
Niasin (Nikotin asit)	Sigma-Aldrich	N4126
Nikel(II) klorür heksahidrat	Alfa Aesar	A14366	Zehirli
N-valerate	Sigma-Aldrich	240370
P-aminobenzoik asit	Çin milletvekili	102569	Zehirli, sinir bozucu
Fosforik Asit	Sigma-Aldrich	P5811
Potasyum dihidrojen fosfat	Sigma-Aldrich	P5504
Potasyum hidrojen fosfat	Sigma-Aldrich	1551128
Piridoksin	Alfa Aesar	A12041
Resazurin	Sigma-Aldrich	R7017
Riboflavin	Alfa Aesar	A11764
Sodyum karbonat	Sigma-Aldrich	1613757
Sodyum klorür	Fisher Biyoreaktifleri	7647-14-5
Sodyum hidroksit	Fisher Chemicals	S320
Sodyum molibadet dihidrat	Acros organikleri	206375000
Tiamin hidroklorür	Acros organikleri	148991000
Triptikaz	BD Biosciences	211921
B12 vitamini	Sigma-Aldrich	V2876
Maya ekstraktı	Sigma-Aldrich	70161
Çinko sülfat heptahidrat	Sigma-Aldrich	Z0251
0.22 μm membran filtresi
AMPür manyetik arıtma boncukları	Agencourt
İnkubator ile anaerobik oda	Forma anaerobik sistem, Thermo Scientific, ABD
Şişe filtresi	Corning
Tülbent
pH ölçer
Girdap	Termobilimsel