Klebsiella pneumoniae tarafından bambu hidrolizatın mikroaerobik fermantasyonu

Özet

Kaynak: Wei, D. ve diğerleri, Klebsiella pneumoniae tarafından hammadde olarak bambu hidrolizatı kullanarak kimyasal üretimi. J. Vis. Exp. (2017)

Bu video, Klebsiella pneumoniae'nin mikroaerobik ve hafif asidik koşullarda hidrolizat bazlı ortamda kültürlenerek bambu kökenli şekerlerin mikrobiyal olarak 2,3-butandiol'e dönüştürülmesini göstermektedir.

Protokol

1. Wildtype K. pneumoniae tarafından 2,3-butandiol üretimi

1. Orta hazırlık için çözücü olarak 3 L bambu hidrolizat kullanın.
2. 4 g/L mısır demli likörü, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 6 g/L K,₂HPO₄, 3 g/L KH₂PO₄ ve 0.2 g/L_{MgSO 4} içeren bir fermantasyon ortamı hazırlayın. Ortamın pH'ını 2,5 M NaOH kullanarak nötr hale getirin. Fermantasyon için 3 L otoklavlı fermantasyon ortamı içeren 5-L biyoreaktör kullanın.
3. K. pneumoniae hücrelerini -80°C düşük sıcaklıklı buzdolabında saklayın.
4. Tohum kültürü için, 50 mL Luria-Bertani (LB) ortamı içeren 250 mL'lik bir şişeyi gece boyunca 37 °C'de, 200 rpm'de çalkalayarak inkübe yapın. 10 g/L tripton, 5 g/L maya ekstraktı ve 10 g/L NaCl içeren LB ortamı kullanın. NOT: Tohum kültürünün hücre yoğunluğu OD 2'ye (optik yoğunluk 600 nm) ulaşmalıdır.
5. Bir şişe, biyoreaktördeki tohum kültüründen 50 mL aşılayın. Kültürü pH 6.0 ve 37 °C'de tutun. Hava takviyesi hızı 2 L/dakika ve 250 rpm çalkalama hızı kullanarak mikroaerobik bir durum oluşturun.
6. Fermantasyon sırasında her 2 saatte 5 mL örnek toplayın ve bunları yüksek basınçlı sıvı kromatografisiyle analiz ederek çorbadaki kimyasal konsantrasyonları belirleyin.
7. Biyoreaktöre eklenen alkalileri mikrobiyal yakıt hücresi sistemi/veri toplama veya MFCS/DA kullanarak çevrimiçi olarak izleyin.
   NOT: Fermantasyon sürecinde organik asitler üretilir ve kültürün pH dengesini korumak için NaOH eklenir. Eklenen alkali hacmi, üretilen asit miktarını temsil eder. Alkalli eklenen çizgi sabitleştiğinde, süreç ya karbon kaynağı tükenmesi ya da hücre ölümü nedeniyle tamamlanır.

2. K. pneumoniae'nin budC mutantı tarafından R-asetoin üretimi

1. 4 g/L mısır demli likörü, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 3 g/L sodyum asetat, 0,4 g/L KCl ve 0,1 g/L MgSO₄ içeren asetoin üretimi için bir ortam hazırlayın.
2. R-asetoin üretimi için K. pneumoniae-ΔbudC kullanılır. 1.4-1.5. adımları tekrarlayın.
   NOT: budC 2,3-butandiol dehidrojenazı kodlar. K. pneumoniae-ΔbudC, 2,3-butandiol dehidrojenaz aktivitesini kaybeder ve 2,3-butandiol yerine R-asetoin üretir.
3. Kültürü pH 6.0 ve 37 °C'de tutun. Hava takviyesi hızı 4 L/dakika ve 450 rpm tahrik hızı kullanın; bu aerobik bir durumdur.
   NOT: Oksijen takviyesi, 2,3-butandiol üretiminden daha yüksektir.
4. Örnekleri 1.6. adımdaki gibi analiz edin.

3. K. pneumoniae'nin mutantı tarafından 2-Ketogluconic Asit Üretimi

1. 2-ketoglukonik asit üretimi için, R-asetoin üretiminde kullanılan aynı ortamı kullanın.
2. 2-ketoglukonik asit üretimi için K. pneumoniae-ΔbudA kullanılır. 1.4-1.5. adımları tekrarlayın.
   NOT: budA , α-asetolaktat dekarboksilazı kodlar. K. pneumoniae-ΔbudA , α-asetolaktat dekarboksilaza aktivitesini kaybeder ve glukozu substrat olarak kullanarak 2-ketoglukonik asit üretir.
   NOT: 2-ketoglukonik asit sentezi, asidik duruma bağlı bir süreçtir. 2-ketoglukonik asit üretimi için iki aşamalı bir fermantasyon geliştirilmiştir; İlk aşamada, tohum kültürü biyoreaktöre aşılanır.
3. Kültürü pH 7.0 ve 37 °C'de tutun. Hava takviyesi hızı 4 L/dakika ve çalkalama hızı 500 rpm'dir.
   NOT: Bu koşullarda hücreler çok hızlı büyür (hücre yoğunluğu yaklaşık 4 saat içinde OD 7'ye ulaşır). Daha sonra fermantasyon ikinci aşamaya geçer ve bu aşamada kültür pH 5.0'a düşer. Asit eklenmez; Kültürde üretilen organik asitler doğal olarak pH düşüşüne yol açar. Bu asidik koşullarda hücre büyümesi durur, ancak 2-ketoglukonik asit sentezlenir ve çorbada birikir.
4. Örnekleri 1.6. adımdaki gibi analiz edin. Bambu hidrolizatını karbon kaynağı olarak kullanmak.
   NOT: Ortamdaki glikoz 2-ketoglukonik asite dönüştürülür ve ksiloz ksilonik asite dönüştürülür. Böylece, 2-ketoglukonik asit ve ksilonik asit karışımı elde edilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Otoklav	SANYO	3780
Biyoreaktör	Sartorius stedim biyoteknoloji	Bostat Aplus
Karıştırıcı	IKA	RW 20
Yüksek performanslı sıvı kromatografi sistemi	Shimadzu Corp	20AVP
Bambu tozu	Çin'in Zhejiang Eyaleti'nden satın alındı		Mesh numarası, 50
Selülaz	Biyokimyasal, Shandong, Çin'e söyle		200 PFU/mL