$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Metabolit Ekstraksiyonu
- Örnekleri ıslak buzda eritin ve hücreleri bir homojenizatorda 6.000 rpm'de dört adet 30 saniyelik patlama ile bozun, döngüler arasında kuru buzda 2 dakikalık soğutma dönemi yapıldı.
- Lizatları 15 dakika boyunca önceden soğutulmuş, soğutulmuş bir mikrosantrifüjde maksimum hızda (yani ≤4 °C'de 18.213 x g) aydınlaştırın.
- Süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Bir mikropipet kullanarak, stepin küçük bir kısmını kalıntı peptid içeriğinin 2. adımda nicelendirilmesi için mikrosantrifüj tüpüne aktarın; Kalan kısmı -80 °C'de sakla.
NOT: Rezerv edilen örnek hacmi, adım 2.1'de kullanılan bicinchoninic acid (BCA) testine bağlı olarak değişir. Bu örnek derhal analiz için ıslak buzda saklanmalı veya -80 °C'de dondurulmalıdır.
2. Bicinchoninic Acid (BCA) Testi
- Kit üreticisinin önerisine uygun olarak, her örnek için kalıntı peptid konsantrasyonunu belirlemek için 1.4. adımdan örnekler kullanılarak bir BCA testi yapılacaktır.
3. Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometrisi (LC-MS)
- 75 μL Staphylococcus aureus (S. aureus) ekstraktını, 75 μL LC-MS çözücü B ile karıştırın; bu çözüm 1.4 adımda hazırlanmıştır.
- Vortex'i karıştırmak ve 13.000 x g g'de 5 dakika boyunca çevirmek için.
- 100 μL süpernatantı sıvı kromatografi (LC) şişesine yerleştirin ve kapalı kapatın. Numunede hava kabarcıklarının sıkışmadığından emin olun.
- LC şişelerini LC-MS otomatik sampler'ına yükleyin ve yazılım "Çevrimdışı Çalışma Listesi Editörü"nde çalışan listeyi düzenleyin.
- "Örnek Adı" (ör. wild-type-1), "Sample Position" (ör. P1-A1), "Method" (ör. Formic Acid-Negative Yöntem) ve "Data File" (örneğin, wild-type-1) sütunlarını doldurun. "Çalışma Listesini Kaydet" butonuna tıklayın. "Kütle Spektrometrisi Veri Toplama İş İstasyonu" yazılımını açın ve daha önce kaydedilen iş listesini girin. Sürekli LC-MS ölçümü başlatmak için "Çalışma Listesi Çalıştırma Başlat" düğmesine tıklayın.
- Örnekleri bir sütunda ayırın, sütunu bir uçuş zamanı (TOF) spektrometresine bağlayın ve TOF spektrometresini LC sistemine bağlayın. Mobil faz gradyanı şu şekilde kullanın: 0-2 dakika, %85 çözücü B; 3-5 dakika, %80 çözücü B; 6-7 dakika, %75 çözücü B; 8-9 dakika, %70 çözücü B; 10-11,1 dakika, %50 çözücü B; 11,1-14 dakika, %20 çözücü B; ve 14,1-24 dakika, %5 çözücü B; %85 çözücü B ile 10 dakikalık yeniden dengeleme süresi ve 0,4 mL min-1 akış oranıyla sona erer.
- İzokratik pompa kullanarak, eşzamanlı kütle ekseni kalibrasyonu için referans kütle çözeltisi infuze edilir.
NOT: Bu adım, standart TOF spektrometre kılavuzuna dayanır.- Gerçek zamanlı kalibrasyonu yapmak için referans kütle çözeltisi olarak asetik asit D4 ve heksakis (1H,1H,3H-tetrafloropropoksi) fosfazinin karışımını kullanın. İnfüzyon için 2.5 mL min-1 akış hızına sahip izokratik pompa kullanın.
4. İyon sayılarının toplu düzeltmesi
- Parti düzeltmesi için referans örnek olarak herhangi bir örneği belirleyin (örneğin, vahşi tip, çoğaltma 1).
- Referans örneklemindeki tüm metabolitlerin iyon sayılarının toplamını hesaplayın. Bu hesaplamayı tüm örnekler için tekrarlayın.
- Her örnekten toplam iyon sayısını, referans örneğinin toplam iyon sayısına bölerek bir oran oluşturulur.
- Bir numunedeki her metabolitin iyon sayısını, örnek/referans oranına bölerek her metabolit için parti düzeltmeli iyon sayısı elde edin.
5. Peptit Normalizasyonu
- 4. adımda elde edilen her örnek için parti düzeltmesi yapmış iyon sayısı değerlerini, 2. adımda BCA testiyle belirlenen peptit konsantrasyonuna bölünerek her metabolit için normalleştirilmiş bir değer elde edin.
NOT: 5.1. adımda elde edilen her metabolit için normalleştirilmiş, parti-parti düzeltilmiş iyon sayıları, suşlar arasında doğrudan karşılaştırılabilir ve istatistiksel analizlere (örneğin, Mann-Whitney U-testi) tabi tutulabilir. Alternatif olarak, tedavi veya genetik arka plan tarafından değişmediği bilinen bir metabolit, metabolit ayrışmasından kaynaklanan değişiklikleri tespit etmek için normalizator olarak kullanılabilir. Ekstraksiyon tamponuna bilinen miktarda L-norvalin veya glutarik asit dahil edilmesi, örnek işleme sırasında kaybı düzeltmek için kullanılabilir.