Otomatik Mikrobiyoreaktörle Farklı Ortam Formülasyonlarında Bakteriyel Büyümenin İzlenmesi

Özet

Kaynak: Hemmerich, J. ve diğerleri. Otomatik Mikrobiyoreaktör Teknolojisi Kullanarak Heterolog Protein Üretiminin Optimizasyonu İçin Protokol. J. Vis. Exp. (2017).

Bu video, farklı ortam formülasyonlarına yanıt olarak bakteriyel büyüme ve floresan protein salgısını izlemek için otomatik bir mikrobiyoreaktör kullanımını göstermektedir. Sekretör floresan protein ifade eden genetik olarak modifiye edilmiş bir bakteri, antibiyotik seçimi altında kültürlenir ve besin çeşitliliğindeki kuyulara aşılanır. Hücre yoğunluğu ve floresansının gerçek zamanlı optik ölçümleri, farklı büyüme koşullarında protein üretiminin karşılaştırmalı analizini mümkün kılar.

Protokol

1. Materyallerin hazırlanması ve tanımlama prosedürleri
NOT: Deneysel yöntemlerin ayrıntılı düzeyde tanımlanması ve sabitlenmesi tavsiye edilir. Bu standartlaşma, farklı sonuçların içsel biyolojik değişkenliğe veya farklı ortam bileşimlerine kadar izlenmesini sağlar. ​
NOT: Medya stok çözümleri: Araştırılan tüm medya bileşenleri için bireysel stok çözümleri hazırlayın. Tüm bileşenler için farklı hacimlerin seyreltilmesine izin verecek şekilde yüksek yoğunlaştırılmış stoklar hazırlayın. Bu, tüm stok çözeltilerinin tasarım planına göre en yüksek hacimde birleştirildikten sonra, nihai yetiştirme hacmini aşamayacağı anlamına gelir; bkz. paragraf "Orta stok çözelti pipetleme listesi oluşturulması" adım 1.3.3. Yüksek yoğunlaştırılmış bir çözelti eklendiğinde çok düşük bir ekleme hacmi elde edilirse, örneğin nihai yetiştirme hacminin 1/100< kadar, stok çözeltisi buna göre seyreltiltilmiştir. Örneğin, bu çalışmada, 10 μL'den küçük bir pipetleme hacminin uygulanamaz olduğu tanımlanmıştır. Genellikle iz element çözeltileri, ortamdaki nihai standart konsantrasyona göre 1.000 kata kadar yoğunlaştırılır. Referans tarifindeki konsantrasyonlara göre ortam bileşenlerini katlar (X-kat) olarak konsantre etmek avantajlıdır. Böylece, uygulanamaz pipetleme hacimleri olan kesirli ondalık ölçüler önlenir. CgXII ortamının tüm stok çözeltileri için ayrıntılı tarifler ek belgede verilmiştir.

1. Çalışan hücre bankası (WCB)
Not: Her büyüme deneyi için bir WCB aliquot kullanılır. Daha fazla aliquot gerekirse, 100 mL beyin kalp infüzyon (BHI) ortamı ile 1.000 mL bracked shake şişelerinde veya gliserol solüsyesi eklenmeden önce biriktirilen birden fazla shake şişesi aşılayın.

1. Rekombinant ekspresyon sızı C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43'ün tek kolonilerini agar plakalarında (37 g/L BHI tozu, 20 g/L agar, 25 mg/L kanamisin) hazırlayın. Kaplama malzemesi ya taze dönüşümden ya da kriyokonserve edilmiş bir aliquot'tan gelebilir. 30 °C'de kuluçkada bulunarak tek koloniler ortaya çıkana kadar; Bu genellikle bir ila iki gün sürer.
2. Bir shaker matarası kültürünü (50 mL BHI ortamı, 25 mg/L kanamisin, 500 mL baffled flas, 250 rpm, 25 mm sallama çapı, 30 °C) koloni malzemesiyle aşılayın ve yaklaşık 16 saat boyunca kuluçka yapın.
3. Ortaya çıkan hücre süspansiyonunun bir hacmini 500 g/L steril gliserol çözeltisi ile birleştirin ve steril kriyokoruma şişelerinde 2 mL aliquot halinde dağıtın. -80 °C'de sakla.

2. MBR yetiştirme protokolü
Not: Bu çalışmada kullanılan BioLector MBR sistemi için, dağılmış ışık (biyokütkütle) ve GFP floresansı yoğunluk ölçümleridir ve belirli bir kazanç değeri atanması gerekir. Kazanç ne kadar yüksekse, optik sinyal o kadar yüksek yükselir; Bu yüzden de saçılan ışık ve floresans rastgele birimlerle (A.U.) ölçülür. Ön deneylerde biyokütle ve GFP tespiti için uygun kazanç değerlerini, ilerleyen süreç aşamalarında daha yüksek biyokütle konsantrasyonlarında oksijen sınırlamasını önlemek için uygun sarsıntı frekansı ve doldurma hacmini belirlemek. Kullanılan yetiştirme koşulları ("Çiçek plakaları" , yani çiçek şeklindeki 48 kuyu makineli MTP'ler, 1.200 rpm'lik sallanma sıklığı, 1.000 μL doldurma hacmi, ana karbon kaynağı olarak 10 g/L glukoz) oksijen-sınırsız yetiştirmeleri sağladı. Çiçek şeklindeki 48 kuyu MTP'lerde doldurma hacmi ve sarsıntı frekanslarının diğer kombinasyonlarından kaynaklanan maksimum oksijen transfer hızları için, tedarikçiden veri sayfaları mevcuttur. Ayrıca, bireysel kültürlerde büyüme kusurları, düşük miktarda ikincil substrat (örneğin azot, iz elementler) nedeniyle meydana gelebilir. Bu nedenle, yetiştirme sonunda biyokütle konsantrasyonlarını kontrol edin. Bu çalışmada böyle bir büyüme etkisi gözlemlenmedi.

1. MBR sistemi ("BioLector") için yetiştirme protokolünü aşağıdaki şekilde tanımlayın:
2. Filtre seti 1: Biyokütle, kazanç 14. Filtre seti 2: pH, gain önceden ayarlanmış. Filtre seti 3: pO2, kazanç önceden ayarlanmış. 4: GFP, 80 kazanç.
3. Sallanma frekansı: 1.200 rpm.
4. Sıcaklık: 30 °C.
5. Döngü süresi: 15 dakika.
6. Deney süresi: manuel (Yetiştirme otomatik olarak durdurulmaz).

3. Orta stoklu çözelti pipetleme listesinin oluşturulması
Not: Neredeyse her sıvı işleme robot sistemi, harici dosyalardan pipetleme işlemlerini okuyabilir. Temelde, gerekli minimum bilgi transfer hacmi ve reaktif kaynağının konumu ile her birinin robotik güvertedeki laboratuvar eşiği konumu ve laboratuvar eşiği içindeki belirli bir boşluk ile temsil edilir. Ancak, farklı sıvı işleme sistemleri için farklı sözdizimi düşünülmelidir. Şekil 1, bu çalışmada kullanılan pipetleme sistemi için örnek bir dosya yapısını göstermektedir.

1. Her yetiştirme kuyusuna dört tür stok çözeltisi pipetlenir:

1. Çeşitli medya bileşenlerinin stok çözümleri ("Varyasyon Stokları").
2. Yukarıdaki stokların farklı kümülatif hacimlerini telafi etmek için su.
3. Tüm sabit bileşenleri içeren bir stok çözümü ("Rest Stock"). Bu stok çözeltisi, örneğin farklı sıcaklıklarda depolanan veya farklı yöntemlerle sterilize edilen farklı bileşenleri içeren stoklardan oluşturulabilir.
4. Inoculum, hücrelerin yerleşmesini önlemek için son bileşen olarak eklenmeli ve eklemeden hemen önce çalışma masasına koyulmalıdır.

2. Yetiştirme kuyusu, tüm medya bileşenleri için aktarılacak hacimleri şu şekilde hesaplayın:

Bazı Varyasyon Stokları için eklenecek hacim sıfır olabilir , yani bu özel bileşen çıkarıldığında.

3. Hesaplanan tüm ciltleri uygun sayılar için revize et. Ses seviyesi artışları çok küçük olmamalıdır. Gerekirse, Varyasyon Stoklarının konsantrasyonlarını ayarlayın. Örneğin, burada minimum pipetleme hacmi 10 μL olarak tanımlanmış, minimum artış ise 5 μL olarak tanımlanmıştır. Genel olarak, bu hacimler, kullanılan sıvı işleme istasyonu için deneysel olarak belirlenen hassasiyet ve doğruluğa dayanarak tanımlanmalıdır.

4. Tüm kuyular için sabit bileşenleri içeren Rest Stock hacmini aşağıdaki şekilde hesaplayın:

burada Varyasyon Stokunun maksimum kümülatif hacmi kullanılır. Sonuç olarak, Rest Stock'taki sabit bileşenlerin gerekli konsantrasyonlarını aşağıdaki şekilde hesaplayın:

Dinlenme stoklarını buna göre hazırlayın.

5. Her bir yetiştirme kuyusu, eklenecek su hacmini aşağıdaki şekilde hesaplayın:

6. Yetiştirme kuyu başına eklenecek tüm ciltleri aşağıdaki ekleme sırasıyla listeleyin: V_H2O, V_RestStock, V_i,_{V Inok}. Pipetleme listesini, örneğin Şekil 1'de gösterildiği gibi, sıvı işleme istasyonunun spesifikasyonlarına göre biçimlendirin.

2. Tohum kültürü, otomatik ortam hazırlama ve ana kültürün başlangıcı.

1. Sıvı işleme robotu için bir protokol oluşturun. "Janus" sistemi için örnek bir protokol için Şekil 2 ve Şekil 3'e bakınız; bu protokol ilgili "WinPREP" yazılımında uygulanmıştır. Protokol aşağıdaki unsurları dikkate almalıdır:

1. Medya hazırlığından önce steril bir yuva süresi ekleyin.

2. Tüm pipet uçları ve borulara ilk aşırı temizlik ve yıkama yapılmasını ekleyin.

3. Stok çözümleri için uygun laboratuvar eşyaları kaplarını seçin. Burada, 12 sütunlu derin kuyu plakaları Varyasyon Stoklarının depolanması için uygundur; çünkü sekiz pipetleme ucu paralel olarak kuyu sütunlarına dalabilir. Bu, medya hazırlıklarını büyük ölçüde hızlandırır. Rezervuar olarak 15 mL veya 50 mL reaktif tüpleri kullanılırsa, aynı anda sadece bir pipetleme ucu içine girebilir. Su ve Rest Stock gibi diğer stoklar için 100 mL çukurlar kullanılır, çünkü bu stok çözümleri toplamda daha yüksek hacim gerektirir.

4. Her stok çözeltisi için atık hacimlerini, yükseklik pipetleme dengelerini vb. telafi etmek için yeterli toplam hacim sağlamak.

5. Aşılama aşamasından önce bir kullanıcı isteği ekleyin, bu adımın tohum kültürü işleminden hemen önce yapıldığından emin olun.

2. Tüm stok çözeltilerini steril bir şekilde hazırlayın ve kullanılana kadar uygun kaplarda, örneğin steril 15 mL ve 50 mL test tüplerinde saklayın.
3. Stok çözelti deposu için derin kuyu plakalarını bir çalışma masasında steril edin; örneğin, %70 etanol ile silinerek ve ardından laminer akış başlıkta kurutularak.
4. Tohum kültürüne, WCB'den alınan bir aliquot ile 25 mg/L kanamisin içeren 50 mL BHI ortamı aşılayarak başlatın. MBR yetiştirmesinden önce, yeterli miktarda katlanarak büyüyen tohum kültürlerinden taze, hayati inokulum hazırlayın.
5. Tüm gerekli laboratuvar malzemelerini robotik çalışma masasına yerleştirin ve ilgili laboratuvar gereçlerine stok çözelyeleri dökün.
6. Ortam hazırlama için robotik iş akışını başlatın, böylece son adım (aşılama) tohum kültürünün başlangıcıyla zamanında ulaşılır. Robotik iş akışının toplam çalışma süresi önceden değerlendirilmelidir. Burada toplam çalışma süresi yaklaşık 1,5 saattir.
7. Yaklaşık 2 saat sonra, ardından her saat başlayarak tohum kültüründen örnekler alın ve büyümeyi optik yoğunlukla izleyin (OD₆₀₀). Yaklaşık 5 saat sonra kültür 3-4 OD_600'e ulaşır ve ana kültürlerin aşılanması için kullanılır.
8. Tohum kültürünü sıvı işleyici çalışma masasına yerleştirin ve medya hazırlama protokolünü sürdürün. Aşılamadan sonra fok yetiştiriciliği MTP.
9. Mühürlü yetiştirme MTP'sini BioLector cihazına yerleştirin ve önceden tanımlanmış yetiştirme protokolünü başlatın.
10. Kalan stok çözeltilerini, gerekirse biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak bertaraf edin ve kültürü robotik çalışma masasından tohumlayın. Yeniden kullanılabilir laboratuvar eşyalarını temizleyin ve sıvı işleyici dezinfekte protokolünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Duyarlılık analizi için ses pipetleme listesinden ekran görüntüsü. İlk sütundaki girişler, bir satırın tüm hacimlerine benzersiz bir tanımlayıcı atar; bu tanımlayıcı, sıvı işleyici çalışma masasındaki hedef yetiştirme MTP'sinin MTP...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BioLector	M2P-Labs	G-BL-100
Çiçek tabağı	M2P-Labs	MTP-48-BOH	BioLector cihazında yetiştirme için
Sızdırmazlık folyosu	M2P-Labs	F-GP-10	Çiçek Plakası için steril sızdırmazlık
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	Yok	Ücretsiz erişilebilir, MATLAB kurulumu zorunlu
Janus pipetleme robotu	Perkin Elmer	Yok	"WinPrep" yazılım kurulumunu içerir
12 sütunlu derin kuyu mikroplakası	E&K Scientific	EK-2034	Orta stok çözeltileri için konteyner
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	Yok	Yok	İfade inserti olarak GFP geni ve B.subtilis'ten PhoD sinyal peptidinin füzyonu olan pEKEx2 plazmidini taşır. Plazmid, kanamisin direnci sağlar. Meissner ve ark. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007) tarafından tanımlanmış ve yayımlanmıştır.