Gliserol veya dimetil sülfoksit kullanarak siyanobakteriyel suşların uzun süreli kriyokonservası

Özet

Kaynak: Lea-Smith, D. J. ve diğerleri. Model siyanobakteriyel türlerde işaretli ve işaretsiz mutantların üretimi. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, konsantre hücre süspansiyonlarını gliserol veya DMSO ile birleştirerek ve düşük sıcaklıklarda depolayarak siyanobakteriyel suşların kriyo-korumasını göstererek fotosentez ve genetik çalışmalar için canlı kültürlerin uzun vadeli korunmasını mümkün kılar.

Protokol

1. Kültür Medyasının Hazırlanması

1. BG11 ortamını hazırlayın
   1. 100x BG11, iz elementler ve demir stok karışımı stok çözeltileri hazırlayın (Tablo 1).
   2. Fosfat stoku, sodyum karbonat (Na₂CO₃), stok N-[Tris(hidroksimetil)metil] -2-aminoetansülfonik asit (TES) tamponu ve sodyum bikarbonat (NaHCO₃) ayrı çözeltiler hazırlayın (Tablo 1).
   3. Fosfat ve Na₂CO₃ stoklarını otoklav olarak kullanır. TES tamponu ve NaHCO_3'ü 0.2 μm filtrelerle filtre sterilize edin.
   4. BG11'i 976 ml su, 10 ml 100x BG11, 1 ml iz elementler ve 1 ml demir stokunu birleştirerek hazırlayın ve çözeltiyi otoklavlayın. Bu çözelti oda sıcaklığına soğuduktan sonra 1 ml fosfat stoku, 1 ml Na₂CO₃ stoku ve 10 ml NaHCO₃ ekleyin.
   5. BG11 katı ortam için, bir şişeye 15 g agar ve 700 ml su ekleyin. İkinci şişeye 3 g sodyum tiosülfat (Na₂S₂O₃), 226 ml su, 10 ml 100x BG11, 1 ml iz element ve 1 ml demir stok ekleyin. Her iki çözümü de otomatik olarak kullanın. Bu çözeltiler oda sıcaklığına soğuduktan sonra birleştirin ve 1 ml fosfat stoku, 1 ml Na₂CO₃ stok, 10 ml TES tamponu ve 10 ml NaHCO₃ ekleyin.
      NOT: Çözeltiler, belirli tuzların çökelmesini önlemek için ayrı ayrı hazırlanır.
2. Sakroz için %50 (w/v) sucrose çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 0,2 μm filtrelerle filtreleyin ve BG11'e (100 ml %50 sakarozdan 900 ml BG11'e) ekleyerek BG11/%5 sakroz plakaları elde edin.
   NOT: BG11/%5 sucrose agar plakalarına NaHCO₃ eklemeyin. Normal olarak Na₂CO₃ ekleyin.
3. Synechococcus kültürü için, 1 L BG11 ortamına 10 ml 1 M 4-(2-hidroksietil)piperazin-1-etansülfonik asit, N-(2-hidroksietil)piperazin-N′-(2-etansülfonik asit) (HEPES) ve 1 ml vitamin B12 (Tablo 1) eklenin.
   NOT: Ticari olarak mevcut BG11 ortamında kültürlenen suşların dönüşümü, burada açıklanan BG11 ortam tariflerine göre çok daha az verimlidir ve bu nedenle önerilmez.

2. Suşların Uzun Vadeli Depolanması

1. Suşun taze kültürünü 30-50 ml BG11 ortamına hücrelerle dolu bir halka aşılayarak kurun. Kültürü 3-4 gün boyunca OD_750nm = 0.4 ila 0.7 olarak yetiştir.
2. Hücreleri bir kez BG11 ile yıkayın ve ~2 ml BG11'e tekrar süzülün.
3. Bir tüpe 0,8 ml konsantre hücre ekleyin. Sonra %80 filtre sterilize edilmiş gliserol 0,2 ml ekleyin.
4. İsteğe göre: 0,93 ml konsantre hücre başka bir tüpe ekleyin. Bu tüpe 0,07 ml DMSO ekleyin.
   DİKKAT: DMSO toksiktir ve uygun koruma ile ele alınmalıdır.
5. Her iki tüpü de -80 °C'de sakla. Suşları canlandırmak için, tüpü çıkarın ve bazı hücreleri antibiyotiksiz bir agar plakasına küt bir kürdanla kazıyın. Steril bir halka kullanarak normal şekilde çizgi çıkar.

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan çözümler

Stok çözelti tarifleri
Kimyasal	Miktar (g)
100x BG11 (L başında)
NaNO3	149.6
MgSO4.7H 2O	7.49
CaCl2.2H 2O	3.6
Sitrik asit	0.6
1.12 ml 0.25 M Na2EDTA ekle, pH 8.0
0.25 M Na2EDTA, pH 8.0 (100 ml başlıkta)
Na2EDTA	9.3
İz elementler (100 ml başlıkta)
H3BO3	0.286
MnCl2.4H 2O	0.181
ZnSO4.7H 2O	0.022
Na2MoO4.2H 2O	0.039
CuSO4.5H 2O	0.008
Şirket(NO3)2.6H 2O	0.005
Demir dipçik (100 ml başta)
Ferrik amonyum sitrat	1.11
Fosfat stoku (100 ml başlıkta)
K2HPO4	3.05
Na2CO3 dipçik (100 ml başta)
Na2CO3	2
TES tamponu, pH 8.2 (100 ml başta)
TES	22.9
NaHCO3 dipçik (100 ml başta)
NaHCO3	8.4
HEPES, pH 8.2 (500 ml başta)
HEPES	119.15
B12 vitamini (50 ml başta)
Siyanokobalamin	0.02
Luria Bertani media (500 ml başlıkta)
Luria Bertani suyu	12.5
1 M MgCl2 (100 ml başta)
MgCl 2.6H 2O	20.33
Çözelti A (200 ml başta)
MnCl2.4H 2O	0.395
CaCl2.2H 2O	1.47
2-(N-Morfolino)etansülfonik asit hidrat, 4-Morfolineethanesülfonik asit (MES)	0.4265
Çözelti A + gliserol
10 ml çözelti A
1,5 ml gliserol

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016
Sitrik asit	Sigma	C0759
NA₂EDTA	Balıkçı	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
Ferrik amonyum sitrat	Sigma	F5879
K₂HPO	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Balıkçı	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Balıkçı	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
Siyanokobalamin	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Sakaroz	Balıkçı	SUC001
Petri kabı 90 mm üçlü havalandırmalı	Greiner	633185
0.2 μm filtreler	Sartorius	16534
100 ml konik şişe	Borcam	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
Füzyon yüksek isabetli DNA polimeraz	Füzyon	F-530
Agarose	Melford	MB1200
DNA arıtma kiti	MoBio	12100-300
Krestriksiyon endonükleazları	NEB
T4 ligazı	Termo Bilimsel	EL0011
Luria Bertani suyu	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Kanamisin sülfat	Sigma	60615
Ampisilin	Sigma	A9518
GeneJET plazmid miniprep kiti	Termo Bilimsel	K0503
14 ml yuvarlak tabanlı tüp	BD şahin	352059
GoTaq G2 Flexi DNA polimeraz	Promega	M7805
425-600 μm cam boncuklar	Sigma	G8772
Gliserol	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Floresan ampuller	Gro-Lux	69
HT multitron fotobiyoreaktör	Infors