$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
A: Arter ve Venöz Dolaşım Cerrahi Kateterizasyon
Bölüm 1: Arter ve Venöz Kateter Hazırlık
- 15 cm kesin PE-50 (0,58 mm iç çapı (0,023) x dış çapı 0,965 mm (.038 "). Kes bir 1mm silastik tüp bölümü (iç çap x 1.65mm 0.76mm (0.030") boncuk frenleyici olarak kullanmak için (0,065 ") dış çapı). frenleyici boncuk yapıldıktan sonra kateter çekerek sıçan önler.
- Mikro diseksiyon forseps ipuçları frenleyici boncuk lümen içine yerleştirin ve nazikçe açılması daha geniş germek için ayrı forseps ipuçlarını tutun. Başka bir çift mikro diseksiyon forseps kullanarak, frenleyici boncuk lümenine silastik tüp kaydırın. Güçlü bir yapıştırıcı tutkal (Loctite Super Glue) ile sabitleyin. Boncuk kateter etrafında düz olmalı. Kateter kurumasına izin verin (24 saat).
- 300 gram sıçan için, arter hattı ~ 2.7cm juguler hattı ~ 3.2cm ise kısıtlama boncuk. Frenleyici Kateter uzunlukları, vücut ağırlığının her 100g artış 0.5cm tarafından ayarlanır. Bu olabilir ponksiyon yerleştirilmesi sırasında damar kateter kenarları konik etmeyin.
- Ameliyattan hemen önce, heparinize salin (10U/ml) çizgileri doldurmak, bir paslanmaz çelik boru fiş ve sterilize etmek için etanol (% 70) ile her iki ucunda mühür. Hava takmadan önce kuru.
Bölüm 2: Cerrahi Hazırlık
- Usul, Calgary Hayvan Bakım Üniversitesi tarafından onaylanan ve Komite kullanın ve theCanadian Derneği tarafından Laboratuvar deneyleri için Zootekni kurallarına uymak. Aşağıda belirtilen usul yetişkin erkek Sprague-Dawley rat (~ 300g) yapıldı. Enjektabl anestezikler kullanmak mümkün olsa tüm prosedürler, izofluran altında yapılmaktadır. Tüm cerrahi işlemler aseptik teknikler sağlamak için yapılır. Cerrahi ekipman, bardak ve heparinize salin otoklavda sterilize edilir. Cerrahi eldiven, şırınga ve pamuk uçlu aplikatörler satın tedarikçi sterilize edilir.
- Sıçan tartılır ve sonuç kaydedilir. Ağırlığı hayvan ameliyat sonrası izleme açısından önemli olacaktır. Ameliyat öncesi seviyelerine tekrar kilo Ancak hayvanların deney için kullanılmalıdır. Bir anestezi kutusunda sıçan (isoflurane% 3) anestezisi. Bir burun konisi kullanılarak ameliyat sırasında izofluran 2% ~ sıçan tutun. Cerrahi asepsi teşvik dezenfekte alanda yapılmalıdır.
- Cerrahi alan (boyun ve omuz bıçakları) saç kaldırarak hayvan hazırlayın. Küçük bir saç kesme makinesi ya da kimyasal tüy dökücü kullanılabilir. Ameliyat yapılacak yerden ayrı bir alanda bu yordamı gerçekleştirin.
- Güvenli cerrahi tablo hayvan. Hayvan varlığı için ayak / göz refleksleri kontrol ederek tamamen uyuşturulduktan olun. Uygun bir cilt dezenfektan ile (% 70 etanol,% 70 etanol ile takip betadin fırçalayın takip) cerrahi siteleri hazırlayın.
Bölüm 3: Cerrahi
- Sternum (forseps ile medial ekseni boyunca uzunlamasına deri Pick up ve makas veya bistüri ile kesme) küçük düşey orta hat kesi 1cm üstün olun.
- Sol sternomastoid kas maruz mikro diseksiyon forseps kullanarak teşrih Blunt. Sol karotis arter yaklaşık 1cm ortaya çıkarmak için bu kas yansıtmaktadır. Karotis arteri altında mikro diseksiyon forseps arter yerinde tutmak için kullanın. Yavaşça karotis arteri bağ dokusu alay. Vagus sinir, arter veya sinirin zarar vermeden arter izole etmek için çok önemlidir. 4-0 ipek sütür (bu ameliyat sırasında karotis arteri işlemek için kullanılacaktır) sefalad sonuna Arter sonra arter izole edin. Not: 4-0 sütür kullanmadan önce% 70 etanol ile sterilize edilmelidir.
- Mikro forseps diseksiyon, dişli ile gemi Kelepçe. 21 gauge VENOJECT Multi-örnek Luer Adaptör ile ponksiyon bağlandı sonuna. Paslanmaz çelik borular fişi çıkarın ve dikkatli bir şekilde steril bir kateter uygulayıcıya artere itiraf yardımı ile kateter yerleştirin. Kateter sağlanması forseps ile güvenli, kısmen arter sıkma mikro diseksiyon forseps bırakın ve boncuk kateter takmadan devam edin. Bu noktada, kateterin ucu aortik ark olmalıdır. Kateter serbest bırakmak için dikkat edin, geminin basınç zorlayacaktır.
- 4-0 güvenli bir şekilde aşağıda boncuk iki sütür ve üzeri bir kravat ve kateter örnek olacağını onaylamak. 10U/ml heparinize salin ile yıkayın. Re-plug, paslanmaz çelik bir boru fişi ile kateter dış sonu.
- Aynı kesi kullanarak, künt sağ eksternal juguler ven maruz teşrih. Dikkatli bir şekilde izole etmek ve ipek sütür ile sefalad Arter. Delinme, 21 gauge VENOJECT Multi-örnek Luer Adaptör ile ven. Paslanmaz çelik borular fişini çıkarın ve steril c kateter eklemekaltında boncuk boncuk ve kravat iki sütür atheter uygulayıcıya. Boncuk üzerinde bir üçüncü dikiş Kravat ve bu örnekleri doğrulamak. 10U/mL salin heparinize venöz hat ile yıkayın. Re-plug paslanmaz çelik boru fiş ile dış kateterin ucu.
- Tünel 14-gauge künt deri altına iğne ve kürek kemikleri arasındaki sırt kesi yapmak. Sıçan arka exteriorize iğne üzerinden kateter Konu. Hattının yaklaşık 4cm görülebilir. Tygon S-50-HL Tıp Boru 0.5cm Kes, exteriorized kateter çevresinde yer ve gerekli (arter, ven mavi kırmızı) gibi bir bant ile güvenli. , Açıklığı sağlamak 150U/ml ile yıkayın ve doldurmak için tekrar test kateterler pıhtılaşmasını önlemek için tuzlu heparinize.
- 3-0 ipek sütür ile bütün kesiler kapatın. Kafesin altındaki gıda, önceden ısıtılmış temiz bir kafese eğilimli Yeri sıçan.
B: Postoperatif Bakım
Bölüm 1: Acil Ameliyat Sonrası Bakım ve İzleme
- Sıçan kez tam ayaktan yeteneği ve uyanıklığı hayvan barınağı sıçan geri kavuşur.
- 3-5 gün sıçan kurtarmak için izin ver.
- Enfeksiyon, ağrı ve ağırlık değişimleri için günlük olarak izleyin. Enfeksiyon kesi siteleri, genel uyuşukluk ve / veya ağrı taburcu görülmektedir endişe olabilir. Ağrı, hunched duruş karıştırdı geri kürk ve ayakta ve / veya yeme davranış yokluğu belirtilir. Kilo kaybı, üç gün sonrası cerrahi ameliyatı hemen ardından deneyimli olabilir, ancak, kilo stabilize etmek ve / veya 5 gün içinde cerrahi öncesi ağırlığı% 10 içerisinde artış gerekir. Ciddi kilo kaybı, enfeksiyon, inme ve / veya ağrı gösterebilir.
- Açıklığı sağlamak için günlük tekrar test kateterler.
Bölüm 2: Kateter açıklık bakımı
- Her gün, post-op kurtarma sırasında 1ml Kayma İpucu Şırınga 150U/ml heparinize salin ile doldurmak ve künt, 22 gauge iğne ile kap. Künt iğne, diğer ucunda 23 Paslanmaz çelik boru kuplörü PE-50 boru 20cm içine eklenir.
- 1 ml şırınganın geri kalanından daha yüksek boru kuplörü sonuna yerleştirme ve hat kabarcıkları dışarı iterek hava kabarcıklarını çıkarın.
- Kelepçe arteryel hat fişi hemen altında hemostat ile sıçan dışsallaştırdığı.
- Hemostat ikinci çifti kullanılarak çelik kateter fişi kaldırın.
- Arteriyel hattı içine şırınga bağlı boru kuplörü takın ve dışsallaşmış arteriyel kateter kapatılmasıy hemostat serbest.
- Şırınganın içine kateter arteryel kan aspire. Kateter kolaylıkla çekmek değilse bu çok nazik damar duvarına sıkışmış olması durumunda kateterin ucu çıkarmak için kateter yoluyla gömme çözüm küçük bir miktar itmek için gerekli olabilir. Kateter kan şırınga ulaştığında tamamen temizlenmiş oldu.
- PE-50 tüp yakın 1ml şırıngayı Kelepçe ve şırıngaya atmayın. Taze 150U/ml heparinli serum fizyolojik ile dolu yeni bir şırınga ile değiştirin. Hortumun çözülme ve yeni bir şırınga tutan dik, yukarı ve hat uzak olası yeni bir hava kabarcıklarını çıkarmak için, bir parmak ile yeni bir şırınga fiske. Not: hava kabarcıklarını bir vuruş neden olabilir Bakım sağlanmalıdır.
- Kateter hattı açık ve ücretsiz kan kadar 150U/ml heparinzed tuzlu su enjekte edilir.
- Kelepçe arteryel hat boru kuplörü hemen altında hemostat ile sıçan dışsallaştırdığı. Arteriyel kateter hattı şırınga konektörü çıkarın ve paslanmaz çelik borular fişi ile değiştirin.
- Dışsallaşmış arteriyel kateter kapatılmasıy hemostat bırakın.
- Venöz hat için tekrarlayın. Ancak, düşük venöz basınç örnekleme nedeniyle çoğu zaman mümkün değildir. Minimum dirençle 150U/ml heparinzed tuzlu su ile aşılanmış ise kateterin damar yerleştirilmiş olması muhtemeldir.
C: hiperinsülinemik öglisemik Kelepçe
Bölüm 1: Kelepçe Set-up ve Hazırlık
- Sıçan tartılır ve ağırlığı kaydedilir. Bu insülin ve glukoz infüzyonu oranlarını belirlemek için gerekli olacaktır. 5h en azından deneme için önce Hızlı sıçan. Bu hayvan postprandiyal bir devlet olmasını sağlar ve şekeri besin kaynakları katkısı en aza indirilir. Aşırı hareketi sınırlar yataklar ile küçük bir kabı / kafes sıçan yerleştirin. Hayvan arkanı dön ve serbestçe damat gerekir.
- Şekil 1'de görüldüğü gibi hatları ve infüzyon pompaları ayarlayın. P50 bağlantı boru uzunlukları aşağıdaki gibidir: Y konnektör şırınga 8cm, sıçan için Y konnektör 15cm, arter hattı 20cm ve venöz hat uzunluğu 10cm. Paslanmaz çelik borular fişlerini çıkarın ve infüzyon sağlamak ve 10U/ml heparinize salin ile sırasıyla örnekleme juguler ve arteryel çizgiler yıkayın.
- Insülin belirleyin hacmi gereklidir. Bu, insülin düzeyi ve sıçan ağırlığına bağlı olarak değişecektir. Burada 4mU/kg/min 2uL/min bir oran uygulanır. Bu yüksek fizyolojik doz. Mümkünse, girişimleri infüzyon hacimleri sınırlamak için yapılmalıdır. İnsülin uygun seyreltilmiş olmalı ve plazma varlığında uygulanmalıdır. Tuzlu su% 3 sıçan plazma çözüm bu laboratuvarda insülin sulandırmak için kullanılır. İnsülin HumulinR 100U/ml (Eli Lily), diğer hızlı etkili insülin istihdam olmasına rağmen. Seyreltilmiş insülin infüzyon şırınga koymadan önce iyice karıştırılır olduğundan emin olun.
- % 50 dekstroz hazırlayın. Bu infüzyon pompası enjektöre doğrudan monte edilebilir. Gelecek karışıklığı önlemek için 'şekeri' ile pompa işaretleyin. Yeterli miktarda insülin ve glikoz için çalışma sağlamak için unutmayın. Kelepçe ~ 2s genellikle son. İşbu Protokol, 3ml şırıngalar kullanılır.
- Harvard Apparatus Modeli 11 Plus Şırınga Pompalar üzerine yerleştirin glukoz ve insülin şırıngaları. Y-Konnektör ve hemostatla kelepçe hattı Avans glikoz. Hayvan önceden insülin, hemostatla hattı kelepçe. Kelepçe ve sıçan, deney başlamadan önce 30 dakika dinlenmek için izin. NOT: Hemostat ucu korumaları hatların sıkma kalıcı önlemek için tavsiye edilir.
- Plazma toplama için santrifüj ve EDTA kaplı tüpler hazırlayın. Bu çalışmada hayvan kenetli sonra, ek kan örnekleri elde edilecektir.
Bölüm 2: Deney Protokolü
- Bazal insülin örnek ve hematokrit örneği elde edilmelidir. Hematokrit örnekleme kan hacmi deney boyunca devam sağlar. Genellikle hematokrit düzeyi başlangıç değerinin% 10'dan fazla düşmemelidir.
- Bazal glukoz örnek alın (One Touch Ultra LifeScan, Inc.) Bağlanarak tüm kan şekeri düzeyini belirlemek. Burada, biz euglycemia kelepçe, veya 5.0-5.5mm (Şekil 2). Her kan örneği sonra, pıhtılaşmayı önlemek için tuzlu heparinize 10U/ml küçük bir hacmi ile arteriyel satırı temizler. NOT: hiçbir pıhtıları veya hava kabarcıkları önce beslerken doğrultusunda emin olun. Bu hayvan bir vuruş verebilir.
- Insülin infüzyonu başlatın. Her zaman noktasında glikoz izleme, 5-10dk aralıklarla kan şekeri atın. Kararlı bir duruma elde edilene kadar gerekli glukoz infüzyon hızı ayarlayın. Bu süreç genelde bir deneme yanılma süreci ve> 2 saat 30 dakika sürebilir. Glisemi korumak için gerekli olan glikoz düzeyleri deney protokolünde, tür ve koşulları (Şekil 2) bağlıdır .
- Kararlı hal glikoz düzeyleri, belirli bir aralık içinde üç ardışık okuma. Burada ~ 1mm içinde üç okuma (örneğin 4.8, 5.2, 5.6mM) kenetli olarak kabul edilir. Kararlı duruma ulaşıldığında, 30 dakika bir süre için glisemi korumak için gerekli olan glukoz infüzyon hızı kaydeder. Bu süre zarfında ek kan örnekleri elde edilebilir. En azından, ikinci bir plazma insülin örnek ve hematokrit örnek alınmalıdır.
- Bir kez kelepçe hayvanlar, ileri analiz için toplanan daha fazla test veya ötenazi ve dokular için kullanılabilir tamamlandı. Hayvan bağlı olarak, kateter hatları 5-7 gün için patent kalabilirsiniz.
D: hiperinsülinemik öglisemik (İnsülin) Kelepçe Sonuçlar
Doğru yapıldığında, kelepçe prosedür sıçan kararlı durum insülin duyarlılığı değerlendirir. Kelepçe elde edilen veriler sunan, glikoz düzeyleri ve glukoz oranları belge esastır. 30 dakika (Şekil 3) en az bir zaman boyunca stabil glikoz düzeyleri kararlı bir duruma işaret etmektedir. Tüm kan şekeri ~ 1mm içinde muhafaza yalnızca glikoz stabil sayılır. Glikoz infüzyon oranları glisemi korumak için gerekli olan eksojen glikoz düzeyleri göstermektedir. Mümkün olduğu durumlarda, bu rakamlar tek, ortalama değeri (Şekil 4) daha ziyade bir zaman ders olarak gösterilmesi gerekir.
Diğer önerilen önlemlerin rapor edilmesi, plazma insülin ve hematokrit. Belirlenmesi hem de açlık insülin düzeyleri ve insülin teyit kelepçeli başarıyla uygulanmıştır ve tedavi grupları arasında (Şekil 5) seviyelerinde herhangi bir farklılık tespit edecektir. Hematokrit önlemler başlangıçta ve insülin kelepçe sonuç elde edilmesi önerilmektedir (Şekil 6). Bu hematokrit seviyeleri, glikoz bertaraf etkisi yoktur, kan hacmi ve akış deney ve beraberindeki değişiklikler sırasında% 5'ten fazla girmemektedir sağlamaktır.
Şekil 1 set-up Deneysel. Şekil 1 kelepçe prosedürü sırasında dizginlenmemiş, bilinçli sıçan gösterir. Kateterler kan örnekleme ve hayvan taşıma olmadan infüzyonları izin verir. Sola Pompalar insülin ve glikoz içerir.
t ">
Şekil 2 kelepçe işlemi sırasında veri bekleniyor. Temel ya da 'kelepçe' elde edilene kadar bazal düzeyde bir kelepçe (euglycemia, 5mM) elde etmek için, eksojen glikoz düzeyleri (D50) manipüle edildi.
Şekil 3 kelepçe prosedürü plazma glukoz sonuçları bekleniyor. Hayvan 'kenetli' olduğunda, kan şekeri, zaman ve deney grupları arasında nispeten istikrarlı.
Şekil 4 kelepçe prosedürü Temsilcisi glukoz oranları. Euglycemia korumak için gerekli ekzojen glukoz miktarı farklıdır. Bu bir kontrol (chow beslenen) ve yüksek yağlı beslenen hayvanlar (insülin dirençli) ile gösterilmiştir. Yüksek yağlı beslenen hayvan aşılanmış insülin duyarsız olması nedeniyle öncelikle glisemi korumak için aşılanmış daha az glikoz gerektirir.
Şekil 5 sıçan Temsilcisi plazma insülin. Insülin klemp sırasında plazma insülin, oruç tuttuklarını, bazal plazma insülin daha yüksek olmalıdır. Bu insülin, insülin kelepçe düzgün sırasında hayvana verildi sağlar.
Şekil 6 hematokrit Raporlama. Bazal hematokrit ve hematokrit deney sonrasında elde edilen ve rapor edilmelidir. Bu hematokrit düzeyleri aşırı arteryel kan örnekleme kaynaklanan bazal düzeylerinin% 5'ten fazla girmemektedir sağlar.