Zebrafish modeli kullanarak mikobakteriyel enfeksiyonda konak bağışıklığının rolünün değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Luukinen, H. ve diğerleri. Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebrabalıklarda tüberkülozun modellemesi. J. Vis. Exp. (2018).

Protokol

Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.

1. Intraperitoneal enjeksiyonla deneysel M. marinum enfeksiyonu

1. Sulandırılmış bakteriyel çözeltinin 5 μL damlasını parafilm filmine pipet yapın ve damlayı 30 G'lik bir insülin iğnesine çekin.
2. Deney için 5–8 aylık vahşi tip balıklar ve rag1−/−hu1999 mutant balıklar kullanın. Yetişkin zebrabalıkları tank suyunda %0,02 3-aminobenzoik asit etil ester (pH 7,0) ile anestezi edin. Balığın ventral tarafını yukarı doğru, nemli köpüklü bir plastik üzerinde bir yarık haline getirin.
   NOT: Rag-/- mutant balıklar somatik rekombinasyon geçirip fonksiyonel T ve B hücreleri üretemez.
3. İğneyi pelvik yüzgeçler arasına yaklaşık 45° açıyla enjekte edin. İğneyi yukarı doğru tutarak tüm açıklığın karın boşluğunun içinde olduğunu kontrol edin. Bakteri süspansiyonunu yavaşça enjekte edin ve iğneyi dikkatlice çıkarın.
   NOT: Enjeksiyon sırasında kırmızı izleyici balıktan sızıyorsa, balığı deneyden dışlayın.
4. Enjeksiyondan hemen sonra, balıkları taze tank suyu olan bir geri kazanma tankına aktarın.
5. Kullanılan bakteri aliquot'tan her 15 dakikada bir 7H10 plakalarında bakteri süspansiyon örnekleri alın ve bakteriyi 5 gün boyunca 29 °C'de kuluçkaya geçirin ve plakalardaki kolonileri sayarak enfeksiyon dozunu doğrulayın.
6. Balıkların sağlığını düzenli olarak kontrol edin ve enfeksiyon belirtileri olan balıkları %0,02'nin üzerinde 3-aminobenzoik asit etil ester (pH 7,0) konsantrasyonuyla ötanaziye yapın.
   NOT: Yaklaşık olarak, 34 ± 15 CFU ile enfekte olan yetişkin zebra balıklarının %7'si ve 2029 ± 709 CFU ile enfekte olan zebra balıklarının %30'u 8 haftaya kadar semptomlar göstermiş olacaktır19. Belirtiler arasında anormal yüzme, dokunmaya tepki vermeme, nefes nefese, ödem veya gözlemlenebilir bir zayıflama olabilir.
7. Zebra balıklarını ortak standartlara göre bakıma tutun

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mycobacterium marinum	Amerikan Tip Kültürü Koleksiyonu	ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
Middlebrock OADC zenginleştirmesi	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Middlebrock 7H9 orta	BD, Thermo Fisher Scientific	11753473
Middlebrock ADC zenginleştirmesi	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Fosfatla tamponlu tuzlu tabletler (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Fenol kırmızı	Sigma-Aldrich	P3532
27 G iğne	Henke Sasss Kurt	4710004020
1 mL şırınga	Henke Sasss Kurt	4010.200V0
Omnican 100 30 G insülin iğnesi	Braun	9151133
3-aminobenzoik asit etil ester (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	A5040