In vitro paralel plaka akış modeli, doku biyopsisinde bakteriyel yapışmayı incelemek için

Özet

Kaynak: Ditkowski, B. ve diğerleri. Greft dokularına bakteriyel yapışkanlığı incelemek için paralel plaka perfüzyon sisteminin in vitro modeli. J. Vis. Exp. (2019).

Bu video, paralel plakalı akış odası kullanılarak floresan etiketli bakterileri damar greft dokuları üzerinde perfüze etme yöntemini göstererek, kesme akış koşullarında bakteriyel yapışma ve erken patogenezin kontrollü analizini mümkün kılmaktadır.

Protokol

Hayvan örnekleriyle ilgili tüm prosedürler, ilgili hayvan etik inceleme komitesi tarafından incelenip onaylanmıştır.1. Paralel Plaka Akış Odası Kullanılarak In vitro Perfüzyon Deneyleri

1. 10 mm çapında ve aynı kalınlıkta doku biyopsilerini, iç yüzeyi yukarıya bakacak şekilde bir akış odası sistemine monte ederek bakteri süspansiyonla temas edin.
   NOT: Farklı greftlerde aynı doku kalınlığı, kanalda aynı doku yüksekliğine ulaşılmasını sağlar ve tüm koşullarda laminar akışa olanak tanır. Akış odasının tüm elemanları Şekil 1'de sunulmuş ve açıklanmıştır.
   1. Protokole başlamak için, yuvarlak doku parçasını 8 mm dairesel delikli bir mikroskop sürgüsü ile kauçuk conta arasında yerleştirin.
      NOT: Mikroskop slaytı, 8 mm deliğin oluşmasına olanak tanıyan ultra ince alt filme sahiptir. Kauçuk tabaka ile birlikte, dokunun sabitlenmesini sağlayarak numune ile akan ortam arasında doğrudan temas sağlanır ve deney sırasında biyopinin yerinden çıkmasını önler. İncelen dokunun yüzeyi, akışa maruz kalan (daha küçük çap) forsepsle manipüle edilemez.
      1. Tutucuyu mendiliyle birlikte odanın alt metal çerçevesine gömülü conta tabakasına yerleştirin.
      2. Üst metal çerçeveyi ve ilgili conta levhasını önceden yerleştirilmiş doku tutucuyla odanın alt kısmına takın. Sonrasında tüm odayı sekiz vida ve vida somunlarıyla monte edin. Greftler arasında odanın yüksekliğinin her zaman aynı olduğundan emin olun.
         NOT: Odanın yüksekliği her zaman vidalar sıkıldığında belirlenmelidir. Bir kaliper veya cetvel kullanın.
2. Akış odasını peristaltik pompa ile ve sıvı rezervuarını borular ile bağlayın.
3. Peristaltik pompa (akış hızı 4 mL/dakika ile doğrulanmış,_{OD 600} (Optik yoğunluk) ölçümleriyle ilişkili) 10⁷ CFU/mL süspansiyonlu dokuları perforize edin (Fosfat tamponlu tuzlu seriş) 3 dyne/^cm2 (dyne/santimetre kare basınç birimi) kesme gerilimi ile peristaltik pompa (akış hızı 4 mL/d) ile 1 saat, 400 mL bakteri rezervuarı kullanılarak (Kendi tasarımı, Şekil 1) 37 °C'de bir plaka termostat kullanılarak kondisyon edilir (Malzemeler Tablosu).
4. Aynı toplama rezervuarı kullanılarak 100 mL bakteri süspansiyonu sürekli olarak yeniden dolaştırın.
5. Perfüzyon sonrası, grefti serbest bırakmak için odayı söküp alın ve doku parçasını laboratuvar orbital sallayıcısı kullanılarak 12 kuyulu bir plakada 4 mL PBS ile iki kez 3 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra, daha küçük çaplı bir cilt biyopsi punch ile greftin iç kısmını kesin.
6. Her doku biyopsisini, içinde 1 mL steril %0,9 NaCl içeren ayrı bir 14 mL tüpe yerleştirin. Tüpü #1 olarak etiketleyin.
7. Bakterileri dokudan 10 dakika boyunca sonikasyon banyosu ile ayırın (genlik = %100 ve frekans = 45 kHz).
   NOT: Doku greftlerinden bakterilerin tam ayrılması, gece boyunca 37 °C'de TSB (Tryptic soya çorbası) sıvı ortamında inkubasyon edildikten sonra kontrol yamalarına kıyasla bakterisiz çözeltiyle işlenmiş OD₆₀₀ ölçümleri yapılarak değerlendirilmelidir.

Sonuçlar

Şekil 1: Yeni geliştirilen bir akış odası sisteminin görüntüsü (dahili tasarım). A. Akış odası (1) monte edilmiş akış seti LxWxH boyutlarında: 125 mm x 55 mm x 18 mm (vidalar, vidalı somunlarla birlikte odanın parçalarını bir arada tutar ve...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sığır perikardiyumu (BP) yaması, Yumuşak Peri-Guard Perikardiyumu	Synovis Surgical Innovations, ABD	PC-0404SN
Sığır jugular damar kanalları (BJV)	Contegra kanalı; Medtronic Inc, ABD	M333105D001
CH kriyokonservatif homograft	Avrupa Homograft Bankası (EHB)	-
Acu-Punch	Acuderm Inc, ABD	P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
İnsan Albümini	Flexbumin; Baxter, Belçika	BE171464LOT:16G12C
Triptik soya suyu (TSB)	Fluka, Steinheim, Almanya	22092-500G
Kalp infüzyon suyu (BHI)	Fluka	53286-500G
Fosfatla tamponlu tuzlu (PBS).	Gibco	14190-094
5(6)-Karboksifloressein N-hidroksisuksinimide esteri (CF)	Sigma-Aldrich, Almanya	21878-100MG-F
Peristaltik pompa (MODEL ISM444B)	İsmatec BVP-Z Standardı; Cole Parmer, Wertheim, Almanya	631942-2
Sonikasyon banyosu	VWR Ultrasonik Temizleyici; VWR, Radnor, Pa	142-6044	230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher tarafından Invitrogen	P36930
Arium Pro VF - ultra saf su - H2O MilliQ	Millipore	87206462
Mikroskobik slaytlar - Doku Kültür Odaları (1-kuyruklu)	Sarstedt	94.6140.102
Lumox çıkarılabilir 1-kuyu üzerinde	Sarstedt	94.6150.101
Paslanmaz çelik - cerrahi bıçaklar	Swann-Morton	311
Tygon Silikon Boru Ünitesi, 1/8"ID x 1/4"OD	Cole-Parmer	EW-95702-06	Sıcaklık aralığı: –80 ila 200°C Terilize et: Etilen oksit, gama ışını veya otoklav ile 30 dakika, 15 psi basınç boyunca
PharMed BPT Tüpleri	Saint-Gobain	AY242012	121°C'de 30 dakika otoklavlanabilir
Tygon LMT-55 Boru	Saint Gobain Performans Plastikleri™	15312022
Termostat	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V, 90VA, 50Hz